卵巢癌患者腹水來源exosome對機體抗卵巢癌免疫功能影響的實驗研究及其蛋白質(zhì)組成分析.pdf

1、本研究為了進一步了解卵巢癌患者腹水來源exosome對特異性抗卵巢癌細胞免疫功能的影響及其相關(guān)機制，探索exosome的蛋白質(zhì)組成，進行了下列五部分實驗。 第一部分卵巢癌患者腹水來源exosome的分離、鑒定和定量。 目的：從卵巢癌患者腹水中分離exosome，并對其進行鑒定和定量。 方法：采集41例卵巢上皮性癌患者的腹水，通過差速離心結(jié)合密度屏障超速離心的方法分離腹水中的exosome，使用透射電鏡和Weste

2、rn Blot方法對exosome進行形態(tài)學鑒定和分子標記物鑒定。通過Bradford蛋白質(zhì)定量法對exosome進行間接定量。 結(jié)果：在85.4％(35/4.1)的卵巢癌患者腹水中成功的分離獲得exosome，但是含有雜蛋白聚合體。電鏡形態(tài)學鑒定和Western Blot分子標志鑒定的符合性良好。每毫升腹水中可以獲得exosome的量為(1.1±0.7)μg。 結(jié)論：從絕大多數(shù)卵巢癌患者腹水中能夠分離獲得典型的exos

3、ome。Bradford蛋白定量法是一種簡便的exosome間接定量法，但是并非最準確的方法。 第二部分卵巢癌患者腹水來源exosome刺激的淋巴細胞對卵巢癌細胞殺傷作用的研究。 目的：探索卵巢癌腹水來源的exosome能否在體外環(huán)境下，改變抗原呈遞細胞和淋巴細胞參與的特異性殺傷卵巢癌細胞的免疫反應(yīng)。 方法：體外分離培養(yǎng)自體卵巢癌細胞、外周血淋巴細胞和臍血誘導分化樹突細胞，將腹水中得到的exosome分別加入樹突

4、細胞和淋巴細胞的混合培養(yǎng)體系以及淋巴細胞單獨培養(yǎng)體系中，7天后用經(jīng)過刺激的淋巴細胞殺傷自體腫瘤細胞和卵巢癌細胞系SKOV3，改良MTT法計算淋巴細胞的抗卵巢癌細胞毒活性變化，ELISA法測定exosome刺激前后以及不同的刺激組間IFN-γ釋放水平的變化。 結(jié)果：實驗中成功的分離、培養(yǎng)了自體卵巢癌細胞和外周血淋巴細胞，從臍血中成功分離誘導獲得樹突細胞。樹突細胞和淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中加入exosome后淋巴細胞對卵巢癌細胞的殺傷

5、率為(6.8±1 5.8)％，而樹突細胞存在時未加exosome組的淋巴細胞對卵巢癌細胞的殺傷率為(16.0±25.9)％；exosome+淋巴細胞組和單獨淋巴細胞組的殺傷率分別為(16.9±30.8)％和(16.0±22.5)％。不論靶細胞是來自自體腫瘤細胞還是SKOV3細胞系，也不論效應(yīng)細胞來自卵巢癌患者外周血還是非腫瘤研究對象的外周血，上述實驗結(jié)果均一致。在樹突細胞和淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中加入exosome后，IFN-γ的釋放水平

6、為(30.1±9.8)pg/ml；未加exosome組為(34.9±12.4)pg/ml；exosome+淋巴細胞組和單純淋巴細胞組分別為(33.0±10.0)pg/ml和(29.2±7.1)pg/ml。將各組淋巴細胞和腫瘤細胞共同培養(yǎng)48小時后，IFN-γ的釋放水平?jīng)]有明顯的變化。 結(jié)論：在樹突細胞存在的條件下，exosome降低外周血淋巴細胞對卵巢癌細胞的殺傷活性。exosome對淋巴細胞釋放IFN-γ的水平?jīng)]有影響。

7、 第三部分卵巢癌患者腹水來源exosome對卵巢癌細胞生長和凋亡的影響。 目的：探索腹水來源的exosome對卵巢癌細胞的生存是否產(chǎn)生影響。 方法：將腹水中獲得的exosome加入卵巢癌細胞ATC和SKOV3，定時測定細胞數(shù)目的變化；annexinV-PI雙染細胞后流式細胞儀測定上述細胞凋亡水平的變化，并在光學顯微鏡下進行驗證。 結(jié)果：將來自不同劑量腹水的exosome加入卵巢癌細胞系SKOV3的培養(yǎng)基中，對S

8、KOV3細胞的生長速度沒有明顯的影響。通過流式細胞儀檢測，加入exosome后自體腫瘤細胞和SKOV3細胞的凋亡水平?jīng)]有明顯的變化。 結(jié)論：腹水來源exosome對卵巢癌細胞的生長和凋亡沒有明顯影響。 第四部分卵巢癌患者腹水來源exosome對抗卵巢癌細胞免疫功能的影響。 目的：初步探索卵巢癌腹水來源exosome可能影響機體抗腫瘤免疫功能的機制。 方法：將腹水中獲得的exosome加入樹突細胞和(或)淋

9、巴細胞的培養(yǎng)體系中，annexinV-PI雙染后通過流式細胞儀判斷上述細胞凋亡水平的變化，并在光學顯微鏡下進行驗證；利用流式細胞儀檢測臍血中樹突細胞前體細胞在加入exosome后向樹突細胞誘導分化的程度是否發(fā)生改變；檢測加入exosome后總淋巴細胞中CD4<'+>淋巴細胞和CD8<'+>淋巴細胞的比例是否發(fā)生改變。Western Blot法和免疫電鏡技術(shù)鑒定exosome懸液中是否存在誘導凋亡信號FasL，使用抗FasL特異性抗體阻斷

10、FasI?？赡芤鸬牡蛲鲎饔?，判斷exosome攜帶的FasL在免疫細胞的凋亡中是否發(fā)生作用。Western Blot鑒定exosome懸液中是否存在Trail，DC和LC表面的Trail受體DR4和DR5通過流式細胞儀進行測定。 結(jié)果：在臍血樹突細胞前體細胞的培養(yǎng)基中加入exosome后，3次獨立實驗中有一次樹突細胞前體細胞的凋亡增加。在沒有發(fā)生凋亡的實驗中，加入exosome獲得的樹突細胞在光鏡水平細胞形態(tài)和未加exosom

11、e組相比沒有差別。如果將exosome加入到成熟樹突細胞的培養(yǎng)基中，3次實驗中有2次觀察到凋亡水平增加。在誘導樹突細胞分化成熟的過程中，加入exosome組CD86的表達較未加exosome組有所升高(50.0±22.0)％和(38.6±13.3)％，其它樹突細胞的表面標志沒有明顯的改變。在exosome+淋巴細胞組，CD4<'+>T細胞/CD8<'+>T細胞的比值為2.4±0.85，而未加exosome的淋巴細胞組為2.0±0.4。如

12、果加入樹突細胞，那么上述兩組CD4<'+>T細胞/CD8<'+>T細胞的比值分別為2.6±1.3和2.5±1.0。將exosome加入淋巴細胞培養(yǎng)體系后，5次實驗中2次觀察到淋巴細胞的凋亡增加；如果將exosome加入樹突細胞和淋巴細胞的混合培養(yǎng)體系中，在6次實驗中3次觀察到淋巴細胞的凋亡增加。利用Western.Blot和免疫電鏡技術(shù)在exosome懸液中發(fā)現(xiàn)存在膜結(jié)合形式的FasL和Tail。不論樹突細胞還是淋巴細胞，使用抗：Fas

13、L抗體進行阻斷實驗時，3次獨立實驗中有1次能夠?qū)xosome引起的凋亡降低到未加exosome的水平。利用流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)LC表達一定程度的Trail受體DR4，DC和LC表達低水平的Tail受體DR5，DC對DR4的表達亦極低。 結(jié)論：由于exosome攜帶有FasL和Trail，exosome可能誘導樹突細胞前體細胞、樹突細胞和淋巴細胞凋亡，并且這種誘導凋亡效應(yīng)能夠部分被抗FasL抗體所阻斷。因為LC表達一定的比例的DR4，

14、故exosome攜帶的Trail可能也參與了誘導LC凋亡的過程。所以淋巴細胞細胞毒活性的降低可能和exosome誘導其凋亡有關(guān)。exosome對腫瘤細胞的生長、樹突細胞的誘導分化以及CD4<'+>T細胞/CD8<'+>T細胞的比例沒有明顯的影響。 第五部分卵巢癌患者腹水來源exosome的蛋白質(zhì)組分鑒定。 目的：探索卵巢癌患者腹水來源exosome的蛋白質(zhì)組成，尋找其中可能對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要效應(yīng)的組分，通過這些組分預(yù)

15、測exosome在卵巢癌患者腹水中出現(xiàn)的意義和可能發(fā)揮的作用。 方法：將腹水中分離并且經(jīng)過鑒定的exosome通過SDS-PAGE電泳使蛋白質(zhì)組分按照分子量大小分開，判斷從不同患者腹水分離得到的exosome在染色劑可分辨的水平(μg/ml)是否有差異。將exosome懸液進行雙向電泳使得蛋白質(zhì)成分按照分子量和等電點的差異分開。將分離的蛋白質(zhì)點酶切消化后通過質(zhì)譜儀進行鑒定。 結(jié)果：來自不同患者的exosome的蛋白質(zhì)條帶

16、在染色劑可分辨水平下沒有明顯的差異。雙向電泳能夠提高對exosome懸液中蛋白質(zhì)的分辨率。質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果顯示，腹水來源的exosome懸液中豐度較高的蛋白是纖維蛋白(原)、白蛋白、免疫球蛋白、補體C3、血紅蛋白亞基，其他可能性較大的蛋白有HSP70、Ⅰ型和Ⅱ型碳酸酐酶、肌動蛋白、角蛋白、錨定蛋白、α-烯醇化酶。沒有鑒定出MHC分子和腫瘤相關(guān)抗原。 結(jié)論：不同患者腹水來源exoosome的蛋白質(zhì)條帶在常規(guī)染色水平?jīng)]有明顯的差異。e