博萊霉素致肺纖維化小鼠肺組織中磷酸化AKT、N-kBp65的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:
　　 肺纖維化(PF)是最常見(jiàn)的肺間質(zhì)疾病也是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重疾病之一,因肺纖維化具有原因不明,致病機(jī)制不清,是多因素的結(jié)果,近年來(lái)信號(hào)傳導(dǎo)通路在肺間質(zhì)纖維化發(fā)生過(guò)程中的異常改變及其導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控的機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。
　　 近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化蛋白激酶B(AKT/PKB)信號(hào)傳導(dǎo)通路在肺纖維化中細(xì)胞增殖、分化、新陳代謝及凋亡過(guò)程中有著重要作用。在一些病理因素的刺激下,AKT蛋白轉(zhuǎn)錄增加或調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致其過(guò)度表

2、達(dá)或異?；罨?通過(guò)作用于下游分子影響細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化生物學(xué)行為?？杀籄KT/PKB通路直接或間接影響下游分子主要包括細(xì)胞增殖和蛋白合成相關(guān)因子和一些凋亡相關(guān)因子。核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB),作為信號(hào)傳導(dǎo)通路的中樞,是AKT下游重要因子之一,通常與其抑制蛋白(inhibitorofKB,IKB)結(jié)合,以無(wú)活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。它的主要形式為p50和p65組成的二聚體,p50是DNA結(jié)合部位,p

3、65參與基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)。在一些病理因素的刺激下,NF-kB的異?；罨烧{(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。
　　 AKT及其下游信號(hào)分子在肺纖維化中的表達(dá)及意義,目前國(guó)內(nèi)外研究尚少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化sP法檢測(cè)磷酸化AKT(p-akt)、NF-kap65在小鼠肺纖維化中的表達(dá)情況,探討磷酸化AKT、NF-kBp65在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用,為肺纖維化的發(fā)病機(jī)理及治療提供新的理論依據(jù)及新的治療靶點(diǎn)。

4、
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (一)實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　 8周齡雌性C57BL/6小鼠(體重17～20克),無(wú)特殊病原體SPF級(jí)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司),寄養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物中心。
　　 (二)主要試劑
　　 1、博萊霉素A2(BLM-A2)15毫克/支(日本化藥株式會(huì)社,批號(hào):H20040205)
　　 2、小鼠抗兔NF-kBp65多克隆抗體,小

5、鼠抗兔磷酸化AKTt(ser473),(ThermoTaKaRa南京凱基公司)
　　 3、即用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)
　　 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立、分組與標(biāo)本處理
　　 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立、分組
　　 將60只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均用lO%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,無(wú)菌手術(shù)暴露氣管進(jìn)行模型制作。實(shí)驗(yàn)組(BL

6、M組):50只,第0天向每只小鼠氣管內(nèi)分別注射20ul含BLM·A2(5mg/kg)的無(wú)菌生理鹽水。對(duì)照組:10只,第0天氣管內(nèi)注入生理鹽水20ul。
　　 (二)標(biāo)本的采集與處理
　　 在實(shí)驗(yàn)的第1、3、7、14、28天對(duì)實(shí)驗(yàn)組取材,每次隨機(jī)選取10只。第7、14天對(duì)對(duì)照組取材,每次隨機(jī)選取5只。以腹腔主動(dòng)脈放血法處死實(shí)驗(yàn)小鼠,將左肺完整取出,放入4%多聚甲醛中固定3h,常規(guī)石蠟包埋,制成4um厚的組織切片,行蘇木素.

7、伊紅染色及免疫組化
　　 三、肺組織常規(guī)病理分析
　　 (一)常規(guī)病理
　　 肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫蠟至水,行HE染色。
　　 (二)肺泡炎癥及纖維化程度的組織病理學(xué)評(píng)分方法
　　 依照Szapid法確定肺泡炎癥及纖維化程度,兩者均分4級(jí),分別記為1、2、3、4分。
　　 四、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)
　　 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP法)檢測(cè)肺組織內(nèi)NF-kBp65、p-akt的定位

8、及表達(dá)。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析,單因素相關(guān)分析采用spearson相關(guān)分析法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、肺組織的病理變化
　　 (一)大體觀察
　　 對(duì)照組各時(shí)間段雙肺表面光滑有光澤質(zhì)地軟色粉紅,實(shí)驗(yàn)組第7,

9、14天雙肺無(wú)光澤可見(jiàn)散在灶性出血點(diǎn)(尤以第7天最為明顯),第28天可見(jiàn)雙肺蒼白、色灰暗無(wú)光澤,質(zhì)地硬。
　　 (二)肺組織病理HE染色顯示
　　 對(duì)照組未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞及大片實(shí)變改變。實(shí)驗(yàn)組第1天僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞,肺泡壁無(wú)明顯變化,小鼠經(jīng)氣管注射BLM后第3天,可見(jiàn)肺泡壁略增寬,肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞滲出;第7天,肺組織內(nèi)呈現(xiàn)典型肺泡炎改變,可見(jiàn)肺泡腔及肺質(zhì)內(nèi)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞為主,肺泡

10、間隔增厚,第14、28天肺泡炎開(kāi)始減輕,肺泡間隔明顯增厚,大量肺泡萎陷,結(jié)構(gòu)破壞,形成多發(fā)片狀實(shí)變。
　　 二、肺泡炎癥病理學(xué)評(píng)分結(jié)果
　　 肺泡炎癥程度病理學(xué)評(píng)分
　　 氣管注射博萊霉素后各時(shí)間點(diǎn),肺泡炎癥評(píng)分與對(duì)照組比較(1.0±0.00)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。第7天肺泡炎病理評(píng)分最高,為3.4±0.50。
　　 三、肺組織磷酸化AKT和NF-KBp65的免疫組化染色結(jié)果
　　 (一

11、)肺組織磷酸化AKT免疫組化染色結(jié)果
　　 在實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中,可見(jiàn)成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化AKT免疫組化染色呈陽(yáng)性,且可見(jiàn)多數(shù)胞漿呈陽(yáng)性表達(dá)。各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較,磷酸化AKT蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05),且隨時(shí)間的移進(jìn)一步增高,14和28天表達(dá)最強(qiáng)(P＜0.05)。正常對(duì)照組小鼠肺組織上述細(xì)胞僅部分胞漿呈弱陽(yáng)性染色,
　　 (二)NF-kBp65免疫組化染色結(jié)果

12、>　　 在BLM組各時(shí)間點(diǎn)處可見(jiàn)肺泡上皮細(xì)胞、肺泡間質(zhì)細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞P65免疫組化染色呈陽(yáng)性,且可見(jiàn)多數(shù)胞核呈陽(yáng)性表達(dá)。正常對(duì)照組小鼠肺組織上述細(xì)胞僅部分胞漿呈弱陽(yáng)性染色,未見(jiàn)細(xì)胞核著色,且第7天與第14天比較無(wú)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的P65表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。氣管注射BLM后第l天,表達(dá)水平明顯高于3天、7天、14天和28天(P＜0.05),第3天表達(dá)較第1天降

13、低(P＜0.05),并呈逐漸下降趨勢(shì),但28天仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 四、磷酸化AKT及NF-kBp65表達(dá)相關(guān)性分析
　　 氣管注射BLM后(1-3天)NF-kBp65與p-akt呈正相關(guān)(r=0.359,P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、p-AKT、NF-kBp65蛋白在肺纖維化中的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常肺組織;
　　 2、在肺纖維化早期,磷酸化AKT及NF-kBp6