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文檔簡介
1、目的:
胰腺炎相關(guān)蛋白1(pancreatitis-associated protein1,PAP1)是一類由胰腺分泌的內(nèi)源性分泌型蛋白質(zhì),大量研究證明,PAP1在炎性疾病中起到保護作用。本研究通過生物信息學方法分析預(yù)測,在人PAP1中篩選出一段由16個氨基酸組成的多肽序列(PAPep),通過體內(nèi)外實驗證明其對眼部炎癥的潛在的抑制作用,并初步探討其抑制炎癥的作用機制。
方法:
1.新型抗炎小肽的生物信息學分
2、析、篩選和合成:本研究采用生物信息學方法,對PAP1的原始氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)分析、生物同源性比對以及氨基酸基本性質(zhì)、生物學特性的計算分析,預(yù)測其抗炎活性氨基酸位點所在,篩選可能具有抗炎活性的多肽序列,并利用固相合成方法合成新型多肽。
2.新型抗炎小肽在內(nèi)毒素誘導的大鼠葡萄膜炎中的作用研究:本研究建立起內(nèi)毒素誘導的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)大鼠模型,通過玻璃體腔注射PAPep進行藥
3、物干預(yù),觀察大鼠炎癥表現(xiàn)、房水蛋白定量、炎性細胞計數(shù)、促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6、ICAM-1和MCP-1)檢測以及組織病理學觀察等方法通過體內(nèi)試驗驗證活性肽對眼部炎癥的抑制作用。
3.新型小肽抑制炎癥的細胞分子機制:本研究通過脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7建立炎癥細胞模型,通過ELISA和RT-PCR檢測PAPep對TNF-α和IL-6表達的影響;進一步利用
4、人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通過單核細胞-內(nèi)皮細胞粘附實驗以及Western Blot檢測內(nèi)皮細胞中粘附分子ICAM-1的表達量以初步探究PAPep抗血管粘附的作用機制。
4.新型小肽抑制炎癥的信號通路研究:本研究應(yīng)用免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀察PAPep對NF-κB激活后向RAW264.7細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況的改變;應(yīng)用Western Blot分別
5、檢測EIU大鼠眼組織以及巨噬細胞、內(nèi)皮細胞內(nèi)NF-κB活化磷酸化狀態(tài)的改變,以及經(jīng)LPS刺激后RAW264.7細胞中MAPK各活性亞基p38 MAPK、ERK和SAPK/JNK的活化磷酸化狀態(tài)的改變情況,初步探討活性肽抑制眼部炎癥的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。
結(jié)果:
1.新型抗炎小肽的生物信息學分析、篩選和合成:生物信息學分析顯示,多肽PAPep不僅含有較多保守殘基,而且具備良好的反應(yīng)特性,包括抗原性、表面接觸活性和親水性
6、等,故從理論角度推測PAPep可能處于PAP1的功能位點內(nèi),具有抑制炎癥的作用。
2.新型抗炎小肽在內(nèi)毒素誘導的大鼠葡萄膜炎中的作用研究:大鼠玻璃體腔注射PAPep可以顯著緩解葡萄膜炎臨床癥狀和評分,減少前房炎性細胞浸潤和蛋白滲出,抑制房水及眼組織中TNF-α、IL-6、ICAM-1和MCP-1等促炎性細胞因子和介質(zhì)的濃度,并改善炎癥引起的眼球組織病理學改變。
3.新型小肽抑制炎癥的細胞分子機制:PAPep可劑量依賴
7、性地降低RAW264.7細胞上清液中TNF-α和IL-6的濃度,并抑制細胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平;PAPep可明顯抑制TNF-α誘導的HuVECs中ICAM-1蛋白的表達,并且阻止單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附。
4.新型小肽抑制炎癥的信號通路研究:PAPep不僅抑制LPS誘導的NF-KB p65向RAW264.7細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,而且減少了眼組織及細胞中磷酸化NF-kBp65的蛋白表達量,且作用呈劑量依賴性;同時
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