甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓HO-1蛋白表達增加及其促痛作用研究.pdf

1、目的：內(nèi)源性一氧化碳(Carbon monoxide，CO)作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì)已經(jīng)被大家所公認。血紅素氧合酶(Hemeoxygenase，HO)是生成CO的限速酶，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其催化亞鐵血紅素Heme產(chǎn)生CO、游離鐵和膽綠素，膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進一步生成膽紅素。HO-1為HO的一種亞型，正常時在神經(jīng)系統(tǒng)表達較少，但可被多種因素所誘導(dǎo)表達。 我室已往的研究已證實，甲醛炎性痛時脊髓后角一氧化氮合酶(Nitri

2、coxide synthase，NOS)活性增加，一氧化氮(Nitrogen monoxidum,NO)產(chǎn)生增多。研究結(jié)果證實，NOS/NO和HO/CO兩個系統(tǒng)之間存在密切的聯(lián)系。有關(guān)HO/CO系統(tǒng)在脊髓傷害性信息傳遞和痛覺過敏方面作用的研究已有一些報道，研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎坐骨神經(jīng)引起的神經(jīng)損傷可誘導(dǎo)脊髓HO表達增多，CO產(chǎn)生增多，但甲醛炎性痛引起的傷害性信息傳入是否會誘導(dǎo)脊髓HO-1表達發(fā)生改變尚未見相關(guān)報道。 有研究證實，鞘內(nèi)給

3、予HO抑制劑可劑量依賴性地減輕甲醛炎性痛大鼠自發(fā)痛行為，表明脊髓后角產(chǎn)生的CO在傷害性信息傳遞和痛感覺方面發(fā)揮重要作用，但有關(guān)HO和CO在熱痛覺過敏和機械痛敏形成中作用尚無定論，有待進一步的研究加以確定。 因此，本實驗采用免疫組織化學(xué)方法，觀察大鼠足底注射甲醛引起的炎性痛過程中，脊髓后角HO-1蛋白表達改變及其時間特征。通過甲醛炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射HO的抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin，Znpp)，觀察其對甲

4、醛炎性痛大鼠的自發(fā)痛行為以及對熱和機械痛覺過敏的影響；通過正常大鼠鞘內(nèi)注射HO激動劑氯化血紅素(Hemin)，觀察其對正常大鼠熱和機械痛閾的影響，探討HO/CO在痛覺過敏形成中的作用。 1.甲醛炎性痛誘導(dǎo)脊髓HO-1蛋白表達改變42只雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±20克，隨機分為7組，分別為正常對照組(control組)、甲醛6h組、甲醛12h組、甲醛1d組、甲醛2d組、甲醛3d組、甲醛7d組，每組6只動物C

5、ontrol組不做任何處理，直接斷頭取材。甲醛各組動物均于足底注射甲醛后行痛反應(yīng)評分，然后于相應(yīng)時間點斷頭取腰5脊髓節(jié)段(L5)，石蠟切片上行HO-1免疫組化染色。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠右后足底注射甲醛后，即刻出現(xiàn)舔、搖、和抬高注射足等自發(fā)痛行為，且注射部位出現(xiàn)紅、腫等明顯的炎癥反應(yīng)，注射足出現(xiàn)典型的雙向性自發(fā)縮足反應(yīng)，持續(xù)1h以上。 免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組大鼠脊髓HO-1免疫反應(yīng)陽性細胞在脊髓后角及中央管周圍

6、僅有極少量分布。足底注射甲醛后，雙側(cè)L5脊髓后角均可觀察到HO-1免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)目即有所增多，雙側(cè)無差別。足底注射甲醛后6h，注射足同側(cè)的L5脊髓后角可觀察到HO-1免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)目即有所增多，陽性面積增大，而灰度值未見明顯降低，中央管周圍陽性細胞數(shù)目也明顯增多；足底注射甲醛后12h時，脊髓后角免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)目進一步升高和陽性面積進一步增大，中央管周圍陽性細胞數(shù)進一步增多；1d時脊髓后角及中央管周圍HO-1陽性細胞數(shù)、陽性面

7、積及灰度值均達到峰值，7d時仍高于正常對照組水平。 2 HO/CO在甲醛誘導(dǎo)的自發(fā)痛及痛覺過敏中的作用45只雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±20克，隨機分為兩個大組。 第一組又分為5個亞組，分別為正常對照組(control組)、甲醛組(F24h組)、甲醛+溶劑DMSO組(DMSO組)、甲醛+Znpp50μg組(ZnPP50μg組)、甲醛+Znpp100μg組(ZnPP100μg組)、甲醛+Znpp300μg組(

8、ZnPP300μg組)，每組5只動物。甲醛+DMSO組和甲醛+各劑量Znpp組預(yù)先鞘內(nèi)注射DMSO或HO抑制劑Znpp，30分鐘后足底注射甲醛并行痛反應(yīng)評分，24h后再次鞘內(nèi)注射DMSO或Znpp，30分鐘后測定熱輻射縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值。 第二組又分為4個亞組，分別為正常對照組(control組)、溶劑NaOH組、Hemin187.5μg組、Hemin375μg組，每組5只動物。溶劑NaOH組和Hemin各組于正常

9、大鼠鞘內(nèi)注射溶劑NaOH和HO激動劑Hemin，30分鐘后測定熱輻射縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲醛炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射HO抑制劑溶劑DMSO后，甲醛誘導(dǎo)的大鼠的痛行為及熱和機械痛覺過敏程度均較甲醛組無明顯改變。而鞘內(nèi)注射HO抑制劑Znpp后，大鼠疼痛反應(yīng)評分較甲醛組明顯降低，且隨Znpp劑量的增大，其對大鼠痛反應(yīng)的抑制作用越明顯。與正常對照組比較，甲醛組大鼠注射足熱輻射縮足潛伏期明顯延長，機械刺激縮足反射閾值也

10、明顯升高，而非注射足熱輻射縮足潛伏期明顯縮短，機械刺激縮足反射閾值也明顯降低；甲醛+Znpp各劑量組與甲醛組相比，注射足熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾值均無明顯變化；而非注射足熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾值均明顯升高，且隨著Znpp劑量的增加，非注射足熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾值明顯高于正常對照組水平。與Control組相比，正常大鼠鞘內(nèi)注射HO激動劑溶劑NaOH后，左右兩側(cè)足熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾

11、值均無明顯差別，正常大鼠鞘內(nèi)注射HO的激動劑Hemin后，雙側(cè)足熱輻射縮足潛伏期縮短，并且機械刺激縮足反射閾值也明顯降低，兩足比較無明顯差別。 結(jié)論：大鼠足底注射甲醛引起的炎性痛誘導(dǎo)了脊髓后角和中央管周圍HO-1表達增多，以注射甲醛后1d增多最為明顯。鞘內(nèi)給予HO抑制劑可明顯抑制甲醛誘導(dǎo)的痛行為反應(yīng)及熱和機械性痛覺過敏程度；正常大鼠鞘內(nèi)給于HO激動劑則可誘發(fā)熱和機械性痛覺過敏的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，HO/CO系統(tǒng)參與傷害性信息的傳