NMDA受體阻斷劑MK-801抑制大鼠甲醛炎性痛及痛過敏時脊髓后角COX-2蛋白及mRNA的表達.pdf

1、目的：前列腺素(prostaglandins，PGs)在脊髓水平傷害性信息的傳遞中發(fā)揮重要作用。環(huán)氧化酶(cyclooxyganese，COX)是合成PGs的限速酶，包括COX-1、COX-2和COX-3三種同工酶。一些研究提示，在傷害性刺激傳入引起痛及痛過敏時，COX-2表達上調、催化合成的PGs增多，進而促進脊髓傷害性信息的傳遞。但是，在此過程中，脊髓后角COX-2的表達增加的機制尚不完全清楚。 大量研究表明，興奮性氨基酸(

2、excitatory amino acids，EAAs)及其受體特別是N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體與脊髓水平傷害性信息的處理以及痛過敏的形成和維持密切相關。同時有研究顯示，在傷害性傳入引起的痛及痛過敏過程中脊髓后角COX-2表達的增加可能與NMDA受體的激活有關。例如，在痛及痛過敏過程中，大鼠脊髓谷氨酸和PGE2的釋放都增加；鞘內給予選擇性COX-2抑制劑能以劑量依賴的方式阻斷NMDA誘導的熱痛敏。

3、我室最近應用免疫組化技術研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠足底注射甲醛或鞘內注射NMDA受體激動劑NMDA誘導大鼠傷害性感受的同時，使脊髓后角COX-2表達增加。預先鞘內注射NMDA受體非競爭性抑制劑MK-801可抑制COX-2表達的上調。這些結果初步提示NMDA受體的活動可能是介導炎性痛及痛過敏過程中脊髓后角COX-2表達增加的原因之一。 本實驗則在此基礎上，進一步應用Western blot和RT-PCR。技術，觀察鞘內給予NMDA受體拮抗劑

4、MK-801對甲醛實驗大鼠脊髓后角COX-2蛋白及其mRNA表達上調的影響，為闡明NMDA受體在介導外周傷害性傳入引起脊髓后角COX-2表達增加中的作用提供更確切的實驗依據(jù)。方法：雄性Sprague-Dawley大鼠170只，體重250-280 g，隨機分為以下各組： sham組：足底皮下注射生理鹽水(normal saline，NS)0.15 ml，按注射后取材觀察的時間，分為1 h、2 h(僅RT-PCR)和1 d組。

5、 甲醛組：大鼠右后足掌面皮下注射5％甲醛0.15 ml，按足底注射后取材觀察的時間，分為1 h、2 h(僅RT-PCR)、4h、1 d和 3 d組。 甲醛+生理鹽水組：首先鞘內給予生理鹽水10 μl，15 min后于大鼠右后足掌面皮下注射5％甲醛0.15 ml。按足底注射后取材的時間，分為1 h、2 h(僅RT-PCR)和1 d組。 甲醛+MK-801組：首先鞘內給予MK-801溶液10μl，15 min后于大鼠右后足

6、掌面皮下注射5％甲醛0.15 ml，根據(jù)MK-801的注射劑量又分為2 nmol、20 nmol和100 nmol三個亞組。每個亞組按足底注射后取材的時間，再分為1 h、2h(僅RT-PCR)和1 d組。 以上各組動物在預定時間點取腰5脊髓后角，應用Western blot分析(各時間點均為5只動物)和RT-PCR法(各時間點均為5只動物)分別測定腰5(L5)脊髓節(jié)段后角COX-2蛋白和mRMA表達的變化。1 h取材前測定足底注

7、射甲醛后60min內的自發(fā)痛行為反應，1 d取材前測定熱輻射縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值。結果： 1.痛行為反應1.1自發(fā)痛行為反應大鼠右后足底注射甲醛后，即刻出現(xiàn)舔、搖、和抬高注射足等自發(fā)縮足痛行為反應，注射足自發(fā)痛行為改變呈現(xiàn)明顯的兩時相性。鞘內注射MK-801可劑量依賴性地降低大鼠60 min內的自發(fā)縮足反射評分(P＜0.05)。 1.2熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足閾值與sham組相比，足底注射甲醛1 d后，

8、可引起注射部位熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足閾值的升高，而非注射足相應部位的熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足閾值則降低(P＜0.05)，表明甲醛注射引起了熱痛覺過敏和機械痛覺過敏(非注射部位)。鞘內給予MK-801可顯著抑制甲醛注射引起的熱痛覺過敏和機械痛覺過敏，表現(xiàn)為甲醛+MK-801各組大鼠非注射足相應部位的熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾值較甲醛+生理鹽水組顯著升高(P＜0.05)，并且這種升高與MK-801的劑量呈正相關。

9、 2甲醛炎性痛及痛過敏上調脊髓后角COX-2蛋白及mRNA的表達在Sham組大鼠，可見L5脊髓后角COX-2蛋白及mRNA均有一定程度的表達。足底注射甲醛后，注射部位同側的脊髓后角內COX-2蛋白的表達在注射后1 h時即有顯著升高，1 d達到表達高峰，3 d恢復至sham組水平(P＜0.05)。上述COX-2蛋白表達上調的時間過程特點與痛行為反應呈現(xiàn)相類似的特點COX-2 mRNA表達的時程與COX-2蛋白相類似，也于注射后1 h開

10、始升高，但表達高峰提前至注射甲醛后2 h。 3 MK-801抑制甲醛炎性痛引起的脊髓后角COX-2蛋白及mRNA表達的上調與甲醛+生理鹽水組相比，甲醛+MK-801組中，無論是注射甲醛后1 h，還是1 d組，大鼠脊髓后角COX-2蛋白及mRNA表達，以及注射甲醛后2 h時COX-2 mRNA的表達均顯著降低，表現(xiàn)為COX-2與β-actin的IOD值的比值降低(P＜0.05)，并且MK-801的劑量越大，COX-2蛋白及mRNA表達的下