轉(zhuǎn)基因番茄標(biāo)記基因剔除及翻譯起始因子4E基因順化植物的病毒抗性.pdf

1、作物遺傳改良依賴于向植物基因組導(dǎo)入外源 DNA 片段。雖然基因工程賦予植物很多通過(guò)常規(guī)育種途徑無(wú)法實(shí)現(xiàn)的優(yōu)良性狀，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其植物產(chǎn)品心存疑慮。植物轉(zhuǎn)基因研究中抗性標(biāo)記基因可以提高轉(zhuǎn)化體的篩選效率。其中70％轉(zhuǎn)基因植物中采用卡那霉素抗性標(biāo)記基因。然而，對(duì)抗性標(biāo)記基因潛在的生物安全性疑慮阻礙了植物轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展，同時(shí)現(xiàn)有可利用的標(biāo)記基因種類(lèi)有限性也阻礙了轉(zhuǎn)基因作物的長(zhǎng)期利用。解決抗性標(biāo)記基因安全性問(wèn)題的策略有標(biāo)記回避和標(biāo)記剔除兩

2、類(lèi)，前者是在轉(zhuǎn)化階段不使用抗性標(biāo)記基因或采用安全標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因植株；后者則采用抗性標(biāo)記基因篩選獲得轉(zhuǎn)化體后剔除標(biāo)記基因。在剔除策略中，可誘導(dǎo)的自主剔除途徑顯現(xiàn)出較好的利用前景。棉鈴蟲(chóng)是一種寄主極廣的農(nóng)業(yè)大害蟲(chóng)，在蔬菜生產(chǎn)區(qū)主要危害番茄。蘇云金芽孢桿菌毒蛋白(ICP)基因是目前應(yīng)用最為廣泛的抗蟲(chóng)基因。本研究?jī)?nèi)容之一旨在以番茄為受體，通過(guò)構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)剔除載體系統(tǒng)用于從抗蟲(chóng)轉(zhuǎn) Bt 基因植物中剔除標(biāo)記基因。 對(duì)作物遺傳改良的另外一

3、個(gè)疑慮是關(guān)于外源基因。對(duì)于這種顧慮使得研究人員考慮是否能夠向植物基因組導(dǎo)入植物自身基因，而不含其他物種基因，即順化基因植物，以區(qū)別于轉(zhuǎn)基因植物。植物病毒病給世界各地的農(nóng)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。隨著植物翻譯起始因子特別是 eIF4E的研究深入，植物抗病毒研究將面臨新的課題。病毒侵染寄主植物并在植物體內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制和增殖需要借助寄主自身蛋白質(zhì)合成機(jī)制。通過(guò)植物基因工程途徑，干擾病毒利用植物mRNA翻譯蛋白質(zhì)的過(guò)程，可抑制病毒在寄主植物內(nèi)的復(fù)制

4、和增殖，不僅可獲得抗病毒植物材料，而且可加深對(duì)植物-病毒互作分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。鑒于此，本研究第二部分內(nèi)容通過(guò)克隆真核翻譯起始因子 4E 相關(guān)基因，利用基因失活和正義表達(dá)順式調(diào)控植物自身eIF4E表達(dá)，提高植物對(duì)馬鈴薯 Y 病毒屬病毒的抗性，探討eIF4E介導(dǎo)的抗病毒性的作用機(jī)理。 本實(shí)驗(yàn)主要開(kāi)展以下研究： 1．利用位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)Cre/lox和化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng) XVE相結(jié)合構(gòu)建標(biāo)記基因剔除載體p35C，在該系統(tǒng)中，反式激活因

5、子X(jué)VE、重組酶基因cre、標(biāo)記基因nptⅡ構(gòu)建于識(shí)別序列l(wèi)oxP正向重復(fù)之間，XVE由位于左側(cè)loxP上游的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，cre由β-雌二醇特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在右側(cè)loxP下游構(gòu)建無(wú)啟動(dòng)子的 cryIAc基因。β-雌二醇誘導(dǎo)處理后，β-雌二醇與反式激活因子 XVE結(jié)合，啟動(dòng)cre基因表達(dá)，Cre重組酶識(shí)別loxP正向重復(fù)位點(diǎn)，發(fā)生重組反應(yīng)，導(dǎo)致兩個(gè)loxP之間的cre、nptⅡ以及 XVE 同時(shí)剔除，將剩下一個(gè)l

6、oxP位點(diǎn)，同時(shí)將cryIAc基因置于35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下。在載體p35G中，目的基因?yàn)間fp，用于通過(guò)綠色熒光蛋白檢測(cè)標(biāo)記基因的剔除。 2．通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化。p35G載體轉(zhuǎn)化番茄中，19個(gè)抗性芽，經(jīng)過(guò)于β-雌二醇誘導(dǎo)后，有2個(gè)再生芽可以觀測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明該誘導(dǎo)自主剔除系統(tǒng)適用于番茄轉(zhuǎn)化。通過(guò)p35C載體將cryIAc導(dǎo)入番茄品種“中蔬五號(hào)”獲得抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)移至含有2μM β-雌二醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基

7、中生根。選取攜帶單拷貝轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行鑒定，對(duì)4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的T1進(jìn)行分析，重組頻率一般在12％～39％之間，完全重組的頻率8％～30％，將標(biāo)記基因 nptⅡ和cre基因剔除。重組區(qū)域序列分析與預(yù)期的重組反應(yīng)一致。其中株系C4所發(fā)生的重組皆為不完全重組。另外，利用λ噬菌體的兩個(gè)重組位點(diǎn)attP構(gòu)建正向重復(fù)序列，置于標(biāo)記基因兩側(cè)，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因當(dāng)代和T1代均未檢測(cè)到重組植株，可能是由于重組加強(qiáng)序列影響其重組效率。 3．部分轉(zhuǎn)c

8、ryIAc基因植株的Northern blot結(jié)果表明，多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株cryIAc的正常轉(zhuǎn)錄。 4．在轉(zhuǎn)基因番茄葉片中表達(dá)量為3500 ng g<'-1>FW～6300 ng g<'-1>FW，而在果實(shí)中CrylAc含量較葉片低，介于2400 ng g<'-1> FW～4400 ng g<'-1>FW之間。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性初步鑒定表明，對(duì)棉鈴蟲(chóng)具有較強(qiáng)的抗性。幼蟲(chóng)校正死亡率在70％～90％之間，轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲(chóng)指數(shù)在80％～

9、90％之間。 5．分別從克隆了番茄品種“中蔬五號(hào)”和抗病辣椒的真核翻譯起始因子4E編碼基因。中蔬五號(hào)番茄所獲得的eIF4E與報(bào)道的序列有3個(gè)堿基差異，而辣椒eIF4E與報(bào)道序列一致。 6．構(gòu)建了辣椒eIF4E正義(超量)表達(dá)載體(pCA4S)及番茄eIF4E RNAi抑制表達(dá)載體(pLE4D)。 7．以番茄品種“中蔬五號(hào)”為受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法用 pCA4S 和 pLE4D兩種載體進(jìn)行遺傳順化，獲得卡那霉素

10、抗性順化植株13株。PCR檢測(cè)和Southernblot 結(jié)果表明，目標(biāo)基因已整合到番茄基因組中。pCA4S載體同時(shí)用于辣椒品種蘇椒五號(hào)的遺傳順化，4株再生辣椒PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，初步確認(rèn)基因己整合到番茄基因組。由于在此實(shí)驗(yàn)中所用目的基因 eIF4E來(lái)自番茄和辣椒自身，我們暫且稱所獲得的基因工程植株為基因順化植株，盡管它們還攜帶非植物自身基因。 8．通過(guò)半定量RT-PCR對(duì)基因順化番茄進(jìn)行eIF4E表達(dá)分析，表明pCA4S順化番茄

11、中eIF4E得到超量表達(dá)，而pLdE4D順化番茄中eIF4E表達(dá)受不同程度抑制。 9．利用摩擦接種對(duì)番茄順化植株進(jìn)行PVY和CMV攻毒感染。通過(guò)對(duì)接種后的病毒病病情調(diào)查和病毒RNA的半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明，pLE4D 和 pCA4S順化植株相對(duì)于對(duì)照均獲得不同程度的病毒抗性。其中pCA4S順化植株的抑制病毒效果較差，而pLE4D順化植株的效果較好。就不同病毒而言，無(wú)論是正義表達(dá)eIF4E或者eIF4E RNA干涉，對(duì)P