重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在酵母GS115中的表達(dá)、純化及其體內(nèi)外生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:獲取具有生物學(xué)活性的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白(CTLA4e),探討其在變應(yīng)性疾病和器官移植排斥反應(yīng)防治中的作用和機(jī)理. 方法:1.重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在酵母GS115中的表達(dá)和純化:首先通過基因操作技術(shù),從pCTLA4/Ig質(zhì)粒中擴(kuò)增400bp的CTLA4胞外區(qū)片段;將CTLA4胞外區(qū)片段插入pPIC9質(zhì)粒中獲取單拷貝酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-CTLA4<,125>并進(jìn)一步構(gòu)建多拷貝酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-CTLA4<,1

2、25>.利用限制性內(nèi)切酶分析、DNA序列測(cè)定在DNA水平對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定.將pPIC9K-CTLA4<,125>質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化GS115酵母;通過篩選獲取穩(wěn)定表達(dá)CTLA4胞外區(qū)蛋白的表達(dá)菌.表達(dá)菌甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵;發(fā)酵上清液經(jīng)超濾、硫酸胺粗分級(jí)分離以及陰離子交換層析,純化出CTLA4胞外區(qū)蛋白.利用Dot-ELISA、SDA-PAGE、Western-blot等方法在蛋白水平對(duì)CTLA4胞外區(qū)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了鑒定.結(jié)論:通過GS115酵母表達(dá)并

3、純化可獲取具有生物學(xué)活性的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白.該蛋白可抑制T細(xì)胞活化、增殖,并可緩解一些因T細(xì)胞活化所介導(dǎo)的免疫相關(guān)疾病如器官移植后排斥反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎.該實(shí)驗(yàn)中短期運(yùn)用CTLA4胞外區(qū)蛋白便具有良好的防治變應(yīng)性鼻炎和移植排斥反應(yīng)的效果,結(jié)合以往該實(shí)驗(yàn)室工作的資料和文獻(xiàn)報(bào)道,提示CTLA4胞外區(qū)蛋白在體生物學(xué)活性的發(fā)揮是基于其誘導(dǎo)針對(duì)特異性抗原的特異性免疫耐受.但CTLA4胞外區(qū)蛋白并未能誘導(dǎo)移植物的長(zhǎng)期存活,這提示CTLA4胞