16334.酵母gs115中鎳柱親和層析結(jié)合蛋白的鑒定

1、汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文I摘要利用外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)具有重要價(jià)值的藥用蛋白是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容和研究熱點(diǎn)，也是各國(guó)政府和制藥企業(yè)競(jìng)相巨額資助的研究領(lǐng)域之一。目前用于重組藥用蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和植物表達(dá)系統(tǒng)。其中，酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖速度快，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低生產(chǎn)成本。酵

2、母表達(dá)外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達(dá)的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，特別適合于表達(dá)真核生物基因和制備有功能的表達(dá)蛋白質(zhì)。酵母表達(dá)系統(tǒng)又分為釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，然而相比較而言，畢赤酵母由于有較強(qiáng)的啟動(dòng)子AOX、蛋白表達(dá)量高和表達(dá)分泌型目的蛋白，在近二十年來(lái)，得到了強(qiáng)烈的關(guān)注。生產(chǎn)后常用的純化方法是固定化金屬離子親和層析（ImmobilizedMetalAffinit

3、yChromatography，IMAC）。然而該方法純化的蛋白，尤其對(duì)疫苗這樣的藥用蛋白來(lái)說(shuō)，純度往往不能達(dá)到要求，因此，還需要許多復(fù)雜的提純方法及手段進(jìn)一步純化如GCMS、LCMS、CEMS、SFCMS、LCNMR、CENMR、LCFTIR等。因此，大批量生產(chǎn)高純度的重組蛋白耗時(shí)耗力?？紤]到在利用IMAC純化重組蛋白時(shí)，影響到重組蛋白純度的主要雜蛋白來(lái)源于宿主細(xì)胞，針對(duì)這一問(wèn)題，有的學(xué)者提出通過(guò)阻斷上游污染源，即利用IMAC獲得影響

4、重組蛋白純度的蛋白，鑒定，敲除或是修飾該蛋白基因，從根源上減少污染源，從而減少了后續(xù)分離純化步驟，同時(shí)降低生產(chǎn)成本的方法。本文以畢赤酵母GS115作為研究對(duì)象，鑒定出該宿主中影響重組蛋白純度的雜蛋白，為簡(jiǎn)化純化步驟，消除蛋白污染源的構(gòu)想進(jìn)行了初步探索。所獲得的研究結(jié)果如下：首先，對(duì)超聲波破碎的功率、超聲時(shí)間、間歇時(shí)間、全程時(shí)間和細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，獲得的最優(yōu)的超聲波破碎條件：細(xì)胞濃度265mgml，破碎條件功率400W，超聲時(shí)間10s，間