兒童喉乳頭狀瘤的臨床轉(zhuǎn)歸與HPV表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、前言: 兒童喉乳頭狀瘤(Juvenile Laryngeal Papilloma， JLP)是廣泛散在性分布于上呼吸道的良性上皮增生性瘤樣病變，具有高度的復(fù)發(fā)性、侵襲性和自限性的發(fā)病特點(diǎn)。其臨床特征以聲音嘶啞及呼吸困難為主，因常引起患兒氣道阻塞而成為一種潛在性的致命因素，目前仍是耳鼻喉科醫(yī)生未解決的難題。1923年Ullman首先提出乳頭狀瘤的病毒病因?qū)W說，人類乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)于19

2、49年由Strauss在電鏡下發(fā)現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)和分子流行病學(xué)的迅速發(fā)展，HPV6，11型與JLP的病因?qū)W關(guān)系也日益明了。我們通過對(duì)37例JLP臨床資料的回顧性分析，結(jié)合對(duì)其免疫組織化學(xué)和HPV6b/11型核酸原位雜交的檢測(cè)，探討兒童喉乳頭狀瘤(JLP)的臨床轉(zhuǎn)歸與HPV不同表達(dá)的相互關(guān)系，有助于臨床醫(yī)生完整地了解HPV6b在JLP發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，深入了解該疾病的病變特征，以期尋求更有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)JLP的發(fā)展和預(yù)后

3、進(jìn)行評(píng)估。 目的: 探討兒童喉乳頭狀瘤(juvenile laryngeal papillo-matosis，JLP)組織中HPV的不同表達(dá)在判斷其臨床轉(zhuǎn)歸中的意義，以尋求更有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)JLP的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。 方法： 1、標(biāo)本來源：選自2001年1月至2006年5月間上海眼耳鼻喉科醫(yī)院收治并經(jīng)手術(shù)治療的JLP存檔石蠟包埋組織塊37例，均經(jīng)病理證實(shí)且有完整的病史資料；另取10例小兒聲帶息肉及1

4、0例正常小兒喉部組織作對(duì)照。 2、實(shí)驗(yàn)切片：復(fù)查所選標(biāo)本的HE切片，JLP的HE染色特點(diǎn)是：大空泡狀細(xì)胞，核嗜堿性，核周有一透明暈包繞。所有手術(shù)組織標(biāo)本須經(jīng)固定、脫水、浸臘和包埋，切片4um。 第一部分免疫組織化學(xué)檢測(cè)(Envision法)。 [1]、試劑：使用的一抗HPV兔抗?？贵w(BPV-1，多克隆)及二抗Envision試劑盒及均購自美國的DAKO公司，工作濃度為1：100，封閉試劑0.3％PBS+0.2％Trit

5、on由華美生物工程提供。 [2]、實(shí)驗(yàn)步驟：常規(guī)脫蠟水化，滴加過氧化物酶阻斷劑(3％過氧化氫)于組織上，直接加用一抗HPV兔抗100ul于組織上過夜，滴加二抗A液(ChemMatetmEnvision+/HRP/DAB)50ul，室溫孵育30 min，滴加顯色劑DAB工作液50ul，蘇木精復(fù)染，封片膠封片。 [3]、結(jié)果判定：HPV-Ag染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為核內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒沉著，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

6、[4]、圖像分析及統(tǒng)計(jì)： ①HPV-Ag染色陽性率采用CMIAS真彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定，著色細(xì)胞(凹空細(xì)胞)占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率<30％為弱陽性(+)，30％～70％為陽性(++)，>70％為強(qiáng)陽性(+++)。 ②統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：組間比較采用方差分析、t檢驗(yàn)及相關(guān)回歸進(jìn)行。 第二部分核酸原位雜交法。 [1]、試劑：地高辛(Digitalin，Dig)標(biāo)記的寡核苷酸探針序列：HPV6b為5'TCT TAC TGT

7、TTG GTA TAC AAT AAC ATA AAA 3'，HPVll為5'CCT TAG TATATT ATG CAC AAT ACC CAC AAA 3'，由上海生工生物工程公司合成，地高辛檢測(cè)(Anti-Digoxigeni-AP)試劑盒由德國羅氏公司提供。 [2]、實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟切片粘貼于玻片上，60℃烤箱過夜，常規(guī)脫蠟，2×SSC/DEPC平衡15 min(室溫)，在組織未干前加HPV6b或HPVll探針混合液20u

8、l/張切片進(jìn)行預(yù)雜交，置42℃恒溫水箱中過夜，雜交后洗滌，滴加封閉液20ul片，37℃30 min，滴加生物素化兔抗地高(Anti-Digoxigenin-AP)，20ul/片，37℃60 min，BCIP/NBT顯色，核固紅短時(shí)復(fù)染，中性樹膠封片。 [3]、結(jié)果判定：HPV感染陽性細(xì)胞表現(xiàn)為核內(nèi)顯示紫藍(lán)色顆粒沉著。 [4]、圖像分析及統(tǒng)計(jì)： ①HPV-DNA及其含量檢測(cè)采用計(jì)算機(jī)彩色病理圖像分析系統(tǒng)(美國IPP

9、圖像分析軟件)，測(cè)定其透光度，即灰度值(A值)，并以平均值作為HPV6b和HPVll的相對(duì)含量(A值越低含量越大)。 ②統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量數(shù)據(jù)采用(-x)±s表示，組間比較采用方差分析、t檢驗(yàn)及相關(guān)回歸進(jìn)行。 結(jié)果： (1)、37例JLP中HPV-Ag染色陽性率為67.3％，HPV6b-DNA、HPVll-DNA及HPV6b+11-DNA的陽性表達(dá)率分別為53.2％、45.8％和25.4％，而聲帶息肉和正常喉部組織

10、中均為陰性表達(dá)，兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (2)、20例HPV6b-DNA陽性的病例，平均發(fā)病年齡為2.1±0.6歲，平均治愈年齡為6.8±2.7歲，19例有復(fù)發(fā)(19/20，95％)；而17例HPVll-DNA陽性的病例平均發(fā)病年齡為3.4±1.5歲，平均治愈年齡為4.3±0.7歲，11例有復(fù)發(fā)(11/17，64.7％)，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明感染HPV6b陽性患兒較感染HPVll