燈盞花加快正畸牙移動的機理研究.pdf

1、第一章燈盞花對鼠正畸牙周組織改建及OPG和RANKLmRNA表達(dá)的影響 目的：觀察大鼠正畸牙移動牙周組織改建中OPG（Osteoprotegerin，護(hù)骨素）、RANKL（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體）的表達(dá)和分布以及燈盞花對其影響。 方法：選用Wistar大鼠64只，隨機分為A、B、C、D四組，每組均以右側(cè)上頜第一磨牙近中

2、腭側(cè)根的牙周組織為實驗觀察部位。A組正畸加力合并局部注射燈盞花，B組單純正畸加力，C組單純注射燈盞花，D組為空白對照。A、B、C組又分設(shè)1、3、7、10、14d觀察小組，每小組4只鼠。每小組鼠到期處死取材，分別進(jìn)行HE染色法觀察各組的組織學(xué)改變，原位雜交法檢測OPG和RANKL陽性表達(dá)的強度和部位。 結(jié)果：①實驗觀察部位的組織學(xué)改變符合正常正畸牙槽骨改建的變化；B組張力側(cè)成骨細(xì)胞增多和新骨形成，壓力側(cè)破骨細(xì)胞增多和骨吸收；A組張

3、力側(cè)和壓力側(cè)除上述變化更明顯外，新生血管增多。②OPG表達(dá)在加力第1、3、7d的張力側(cè)和壓力側(cè)牙周組織中均逐漸增強，而在10、14d則逐漸減弱；OPG的表達(dá)部位主要在張力側(cè)的成骨細(xì)胞、骨襯里細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和壓力側(cè)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，但在破骨細(xì)胞中不表達(dá)；合并燈盞花注射組的OPG表達(dá)部位不變，但陽性表達(dá)有所減弱。③RANKL表達(dá)在加力第1、3、7d的張力側(cè)和壓力側(cè)牙周組織中均逐漸增強，而在10、14d則逐漸減弱；R

4、ANKL的表達(dá)部位在張力側(cè)和壓力側(cè)的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨襯里細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞；合并燈盞花注射組的RANKL表達(dá)部位不變，陽性表達(dá)明顯增強。 結(jié)論：在大鼠正畸牙移動過程中，OPG和RANKL參與了牙周組織的改建；而燈盞花能抑制OPG的表達(dá)和增加RANKL的表達(dá)，增加RANKL/OPG的比值，從而加快正畸牙移動。 第二章不同濃度燈盞花對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞增殖和分化的影響 目的：通過MTT法

5、、[3H]TdR摻入法和臺盼藍(lán)拒染法體外研究不同濃度燈盞花對成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞的增殖和分化的影響。 方法：體外培養(yǎng)MG-63成骨樣細(xì)胞和RAW264.7破骨前體細(xì)胞。 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：RAW264.7細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板，分別用50 ng/ml RANKL+25ng/ml M-CSF和不同濃度（0.001～1mg/ml）的燈盞花干預(yù)，第6天TRAP染色，顯微鏡下計數(shù)TRAP陽性多核破骨細(xì)胞。

6、MTT法：MG63細(xì)胞或RAW264.7細(xì)胞以1×104個/孔接種子96孔板，培養(yǎng)24小時后用含不同濃度的燈盞花的無血清的DMEM培養(yǎng)液干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)36小時，每孔加入MTT，繼續(xù)孵育4小時，每孔加入150μl的DMSO，測570nm波長的吸光值（OD值）。 [3H] TdR摻入法：MG63細(xì)胞或RAW264.7細(xì)胞以2×104個/孔密度培養(yǎng)于24孔板中，24小時后用0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml燈盞花干預(yù)32小

7、時后，每孔加入[3H]TdR，測定細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的[3H] TdR量。 臺盼藍(lán)拒染法：MG63細(xì)胞或RAW264.7細(xì)胞以2.5×104/ml密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實驗組用1mg/ml燈盞花干預(yù)細(xì)胞1～6天。每天取細(xì)胞臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)計數(shù)6天，繪制細(xì)胞生長曲線。 結(jié)果：單獨應(yīng)用燈盞花不能使RAW264.7細(xì)胞形成TRAP陽性多核破骨細(xì)胞，但0.01-1mg/ml濃度燈盞花均能促進(jìn)RANKL和M-CSF共同作

8、用下誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞。 MTT法和[3H] TdR摻入法檢測顯示燈盞花促進(jìn)MG-63細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)劑量依賴性，于1mg/ml劑量時，促增殖的作用最為顯著。 臺盼藍(lán)拒染法檢測顯示，MG63和RAW264.7細(xì)胞對照組和干預(yù)組在培養(yǎng)時間內(nèi)生長呈現(xiàn)上升趨勢，燈盞花干預(yù)組的細(xì)胞數(shù)增加更明顯，且隨著時間的延長，燈盞花的促增殖作用越明顯。 結(jié)論：燈盞花能促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨

9、前體細(xì)胞的增殖并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，同時能協(xié)同RANKL和M-CSF誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞。 第三章燈盞花對成骨細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞OPG/RANKL/RANK表達(dá)的影響 目的：研究燈盞花在不同濃度不同時間下對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞中OPG/RANKL/RANK mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以初步探討燈盞花對骨改建的作用及其機理。 方法：體外培養(yǎng)MG63細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，取第三代細(xì)

10、胞分為對照組和不同的實驗組，分別應(yīng)用不同濃度的燈盞花（0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml干預(yù)不同時間（12、24、48h）后，提取總RNA和蛋白質(zhì)，用半定量RT-PCR方法檢測MG63細(xì)胞OPGmRNA和RANKL mRNA的表達(dá)以及RAW264.7細(xì)胞RANK mRNA的表達(dá)，用Western blot方法檢測MG63細(xì)胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表達(dá)以及RAW264.7細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：RT-PC

11、R和Western blot結(jié)果顯示，燈盞花隨濃度（0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml）增高，呈劑量依賴性抑制MG63細(xì)胞OPGmRNA和蛋白的表達(dá)，同時呈劑量依賴性促進(jìn)MG63細(xì)胞RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)。 Western blot結(jié)果還顯示燈盞花呈時間依賴性地促進(jìn)MG63細(xì)胞RANKL蛋白的表達(dá)。1mg/ml燈盞花干預(yù)12h、24h、48 h后，RANKL蛋白量均顯著增高。 RT-PCR和We

12、stern blot結(jié)果顯示，燈盞花隨濃度（0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml）增高，呈劑量依賴性促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞RANK mRNA和蛋白的表達(dá)。 Western blot結(jié)果還顯示燈盞花呈時間依賴性地促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)。1mg/ml燈盞花干預(yù)12h、24h、48 h后，RANK蛋白量均顯著增高 結(jié)論：燈盞花呈劑量和時間依賴性抑制成骨細(xì)胞OPG表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞RANKL的表

13、達(dá)和破骨前體細(xì)胞RANK的表達(dá)，提示燈盞花可能有促進(jìn)骨吸收的作用。 第四章燈盞花聯(lián)合機械牽張力對成骨細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞OPG/RANKL/RANK表達(dá)的影響 目的：分別研究燈盞花、機械牽張力以及燈盞花與機械牽張力聯(lián)合作用下對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞中OPG/RANKL/RANK mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討燈盞花對骨改建的作用及其機理。 方法：體外培養(yǎng)MG63細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，采用SX

14、G4201型四點彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀對細(xì)胞進(jìn)行機械牽張力刺激。分別單用機械牽張力刺激（2000μ strain，0.2Hz）、單用燈盞花（1mg/ml）干預(yù)、以及機械牽張力（2000μstrain，0.2Hz）和燈盞花（1mg/ml）聯(lián)合干預(yù)MG63細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞不同時間（3，6，12，24h）后，提取總RNA和蛋白質(zhì)，用半定量RT-PCR方法檢測MG63細(xì)胞OPGmRNA和RANKL mRNA的表達(dá)以及RAW264.7細(xì)胞R

15、ANKmRNA的表達(dá)，用Western blot方法檢測MG63細(xì)胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表達(dá)以及RAW264.7細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：在選定的3、6、12、24h四個時間段，隨著機械牽張力對細(xì)胞刺激時間的增加，MG-63細(xì)胞OPG蛋白的表達(dá)逐漸增強，MG-63細(xì)胞RANKL蛋白和RAW264.7細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)沒有顯著改變。 單用機械牽張力刺激MG63細(xì)胞后OPG蛋白表達(dá)上調(diào)，而RANKL蛋白表達(dá)

16、無明顯變化；單用燈盞花干預(yù)MG63細(xì)胞后OPG蛋白表達(dá)下調(diào)，而RANKL蛋白表達(dá)增加；兩者聯(lián)合干預(yù)MG-63細(xì)胞后，OPG蛋白表達(dá)量減少，而RANKL蛋白表達(dá)顯著增加。 單用機械牽張力刺激RAW264.7細(xì)胞后RANK蛋白表達(dá)無明顯改變；單用燈盞花干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后，RANK蛋白表達(dá)增加；兩者聯(lián)合干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后，RANK蛋白表達(dá)量顯著增加。 結(jié)論：燈盞花能拮抗機械牽張力對成骨細(xì)胞OPG分泌的刺激作用，