感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)對糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面的促愈作用及應(yīng)用性研究.pdf

1、糖尿病是由于胰島素絕對或相對不足及胰島素抵抗造成的以高血糖為典型臨床表現(xiàn)的全身代謝紊亂綜合癥。其發(fā)病率呈逐年升高趨勢，目前影響著全球約1～2％的人口。糖尿病的嚴重性不在糖尿病本身，而在其并發(fā)癥，如糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病難愈創(chuàng)面及潰瘍等。調(diào)查表明，糖尿病患者其神經(jīng)病變的發(fā)生率高達90％～100％，而此類患者往往伴隨有皮膚潰瘍及創(chuàng)面愈合不良。因足部潰瘍導(dǎo)致的截肢及相關(guān)治療費用在美國平均每年高達100多億，中國

2、每年用于糖尿病的醫(yī)療費估計約400億人民幣，其中80％的費用主要是用于糖尿病并發(fā)癥的防治。目前對引起糖尿病皮膚潰瘍及創(chuàng)面難愈的機制尚不清楚，但與外周感覺神經(jīng)病變密切相關(guān)。近年來研究表明，感覺神經(jīng)末梢分泌的神經(jīng)肽P物質(zhì)是創(chuàng)傷修復(fù)過程中的重要因子，不僅能夠促進多種修復(fù)細胞的增殖、遷移、分化，更重要的是調(diào)節(jié)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF、bFGF、EGF等的細胞合成及分泌，從而促進組織修復(fù)。因此，深入研究感覺神經(jīng)及其釋放的神經(jīng)肽在糖尿病難愈創(chuàng)面的作

3、用及機制，合理有效的使用外源性的神經(jīng)肽制劑可為糖尿病難愈創(chuàng)面的治療提供新的方法和思路。 方法：本實驗首先采用鏈尿佐菌素(STZ)所致的糖尿病大鼠模型，利用免疫組化及酶聯(lián)免疫技術(shù)觀察了糖尿病大鼠在發(fā)病后不同時間其皮膚SP陽性神經(jīng)的分布特點及局部含量變化，H-E染色觀察皮膚組織在光鏡和電鏡下的病理改變。在此基礎(chǔ)上，采用背部全層皮膚切割傷，觀察外源性應(yīng)用感覺神經(jīng)肽SP對糖尿病大鼠難愈傷口的促愈作用。進一步采用多囊脂質(zhì)體包封技術(shù)，制備S

4、P多囊脂質(zhì)體，通過觀察組織宏觀和微觀的變化，驗證SP多囊脂質(zhì)體對難愈傷口的促愈作用。通過對SP蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的分析，初步合成一種來源于SP的N端6肽，同時驗證了其對糖尿病大鼠皮膚難愈傷口的促愈作用。旨在優(yōu)化感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)在難愈傷口中的促愈效果，為其進一步的臨床應(yīng)用奠定理論和實驗基礎(chǔ)。實驗中同時采用免疫組化熒光標記的方法研究了糖尿病大鼠皮膚及肉芽組織中NK1和NK2受體的表達特點，采用原位雜交的方法觀察外源性神經(jīng)肽P物質(zhì)對組織修復(fù)過程中

5、主要修復(fù)細胞內(nèi)源性P物質(zhì)表達的影響，初步探討了外源性P物質(zhì)對難愈傷口的促愈機制。 結(jié)果：經(jīng)鏈尿佐菌素腹腔注射后一周，大鼠血糖升高并穩(wěn)定在16.7mmol/L以上。免疫組化顯示糖尿病大鼠發(fā)病后4～6周其皮膚中SP陽性神經(jīng)明顯減少；ELISA法測定皮膚中P物質(zhì)含量下降；光電鏡觀察其皮膚組織發(fā)生病理改變，表現(xiàn)為表皮及真皮變薄，成纖維細胞胞漿及細胞突起減少，染色質(zhì)致密團塊，提示細胞增殖活性減弱。有髓神經(jīng)表現(xiàn)為髓鞘水腫、變性、溶解，軸突被

6、擠壓，雪旺氏細胞變性，纖維裸露；無髓神經(jīng)表現(xiàn)為水腫、空泡化，微絲位管排列不整齊；糖尿病大鼠皮膚傷口肉芽組織中SP含量、SP陽性細胞數(shù)減少；糖尿病大鼠創(chuàng)傷后，NK1受體陽性細胞染色減弱，而NK2陽性細胞染色增強；外源性應(yīng)用SP后，修復(fù)細胞對SP的表達增強；傷口愈合速度明顯加快，比正常對照組可提前7天；傷口中膠原含量增加，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例及排列改變；炎癥期提前，修復(fù)細胞提前出現(xiàn)，血管形成增加；采用正交設(shè)計多囊脂質(zhì)體包封SP后，脂質(zhì)體型SP相

7、變溫度34℃，熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，電鏡觀察粒徑分布在0.75～27.75μm之間，可在傷口中持續(xù)釋放達三天，濃度范圍10-7M～10-9M之間，局部濃度明顯提高，且脂質(zhì)體型SP制劑可達到理想的促愈效果。合成來源于SP的N端6肽，在傷口使用濃度10-6M，可使傷口愈合的時間提前2～3天。 結(jié)論：1.糖尿病大鼠皮膚中SP含量及SP陽性神經(jīng)的減少與其皮膚的病理改變密切相關(guān)。 2.糖尿病大鼠皮膚感覺神經(jīng)的完整性是皮膚神經(jīng)肽代謝的重要

8、前提。 3.應(yīng)用外源性的SP可促進糖尿病大鼠創(chuàng)面修復(fù)細胞對內(nèi)源性的SP表達增強，提示外周感覺神經(jīng)釋放的SP是創(chuàng)面內(nèi)源性神經(jīng)肽表達調(diào)控的重要因素。 4.免疫組化半定量分析結(jié)果顯示，糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷后不同時期，其創(chuàng)面NK2受體較NK1受體表達增強，提示SP在促進糖尿病難愈創(chuàng)面的修復(fù)過程中，可能通過NK2受體途徑發(fā)揮代償作用。 5.應(yīng)用外源性SP可促進糖尿病難愈創(chuàng)面的修復(fù)，愈合時間比不用SP可提前4～7天，愈合質(zhì)量明