促生長激素神經肽及其受體系統(tǒng)在大鼠糖尿病神經病變中的作用.pdf

1、糖尿病神經病變是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，早期癥狀主要為感覺的障礙，臨床表現(xiàn)為對稱性的疼痛和/或感覺異常，以下肢遠端為著，晚期可出現(xiàn)下肢的潰瘍，糖尿病足，甚至導致截肢。不幸的是，由于對糖尿病神經病變的病理生理機制認知的缺乏，目前的治療效果并不理想。在糖尿病中，病理學上出現(xiàn)周圍神經纖維萎縮、脫髓鞘、纖維丟失和再生障礙，但其發(fā)生進展機制尚不完全清楚。
　　 促生長激素神經肽(galanin，Gal)是一種高度保守和廣泛分布在中樞

2、和外周神經系統(tǒng)的神經肽。它參與和調節(jié)體內許多重要的生理、病理過程，例如痛覺調節(jié)、神經保護、神經內分泌、認知、癲癇和腫瘤等，尤其是前兩者，是近年研究的熱點。Gal的所有功能由其G蛋白耦聯(lián)的受體所介導。Gal受體1(galaninreceptor1，GalR1)和Gal受體2（galaninreceptor2，GalR2）廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)和周圍神經節(jié)中。Gal受體都可以通過耦聯(lián)Gi/o蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化。但不同的是GalR2

3、還可以和Gq/11耦聯(lián)，從而激活磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)和蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)。
　　 在正常的情況下，Gal在背根神經節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）的部分小神經元和脊髓灰質第Ⅱ層膠狀質中的神經元中低表達，而在周圍神經損傷后，其表達明顯上調，這很可能是神經系統(tǒng)對神經損傷后的適應性反應。DRG和脊髓灰質后角(spinaldorsalhorn，SDH)中Gal

4、表達的上調，在神經病理性疼痛狀態(tài)下起著重要的調節(jié)作用。已有研究表明鞘內注射Gal可以減輕神經損傷引起的神經病理性疼痛。目前許多的研究表明，Gal的鎮(zhèn)痛功能由GalR1介導，但其確切的抑制疼痛的信號轉導機制尚不清楚。GalR2通過耦聯(lián)Gq/11激活PLC和PKC，繼而激活Akt和ERK信號轉導通路，參與神經元營養(yǎng)保護和促進軸突再生的功能。
　　 已有研究表明Gal及其受體GalR1和GalR2在多種類型的神經病變中發(fā)揮著重要的作用

5、，但其在糖尿病神經病變發(fā)病過程中的作用，目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的坐骨神經損傷后，表達Gal的神經纖維再生延遲，并可能加重了神經病理性疼痛。進一步探討Gal及其受體系統(tǒng)在糖尿病神經病變中的作用及其機制，對開展糖尿病神經病變的治療新戰(zhàn)略具有重要意義。
　　 本課題運用體內、外模型和多種實驗方法，對Gal及其受體GalR1和GalR2在糖尿病神經病變中的痛覺調節(jié)與神經保護中的作用進行實驗研究。
　　 第一部分，促生

6、長激素神經肽對體外高糖培養(yǎng)的背根神經節(jié)神經元的影響作用
　　 高血糖被認為是引起糖尿病神經病變的主要原因。高血糖的糖尿病患者最終會發(fā)展成為某種形式的糖尿病神經病變。高濃度的葡萄糖能引起神經元損傷，這被認為是糖尿病神經病變的一個決定性因素。實驗證明，高糖可引起體外培養(yǎng)的DRG神經元凋亡。Gal不僅參與體內的血糖和能量調節(jié)，而且具有神經元保護作用。但Gal對體外高糖培養(yǎng)的DRG神經元的作用及其受體的影響，尚不清楚。
　　 基

7、于以上研究背景，本課題設計如下實驗:
　　 胎齡為15d（embryonicday15，E15）胚胎大鼠的DRG神經元，體外分散培養(yǎng)48h后，隨機分為5組:(1)高糖組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium內加入葡萄糖至終濃度為45mmol/L;(2)高糖+Gal組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium內加入葡萄糖至終濃度為45mmol/L，加入Gal至終濃度1μmol/L;(

8、3)Gal組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium內加入Gal至終濃度1μmol/L;(4)甘露醇組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium加入甘露醇至終濃度20mmol/L，模擬高糖引起的高滲環(huán)境;(5)對照組:葡萄糖濃度為25mmol/L的neurobasalmedium，不施加任何干預因素。檢測細胞內活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)水平，檢測細胞的活性

9、，檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活，觀察Hoechst33342染色細胞核形態(tài)的改變，Real-timeRT-PCR和Westernblot技術檢測Gal及其受體GalR1和GalR2的表達。
　　 實驗結果如下:
　　 (1)高糖培養(yǎng)可致DRG神經元胞內ROS水平升高，細胞活性下降，caspase-3激活，細胞凋亡，并引起Gal表達上升，GalR1表達下降。
　　 (2)外源性的Gal可

10、以顯著減輕高糖所致的神經元ROS水平升高和活性下降，減少caspase-3的激活和細胞的凋亡。外源性的Gal顯著減輕高糖所致的Gal表達上升，但可進一步下調GalR1的表達。
　　 (3)各種實驗條件對DRG神經元GalR2的表達無顯著影響。
　　 以上結果表明，Gal及其受體系統(tǒng)參與了體外高糖分散培養(yǎng)的DRG神經元損傷過程。DRG神經元中Gal和GalR1在高糖或外源性Gal的培養(yǎng)條件下表達具有可塑性，而GalR2的表

11、達則變化不明顯;外源性Gal可以減少體外分散培養(yǎng)的DRG神經元高糖損傷所引起的凋亡。Gal對高糖損傷的DRG神經元具有明顯的保護作用。這一實驗結果為進一步探討Gal及其受體在糖尿病神經病變中的作用提供了實驗依據和新的思路。
　　 第二部分，促生長激素神經肽對糖尿病神經病變大鼠疼痛的作用及其機制
　　 糖尿病神經病變能引起痛覺過敏和異常性疼痛，但引起這種神經病理性疼痛的機制尚不清楚。DRG神經元是感覺傳導通路的第一級神經元

12、，參與了糖尿病神經病變。已經證實DRG是糖尿病感覺性神經病變的最常累及的組織之一。SDH是感覺尤其是痛覺傳導和調節(jié)的重要中樞，有研究表明它也參與了糖尿病中神經病理性疼痛的調節(jié)。已有實驗證明，Gal及其受體參與了神經病理性疼痛的調節(jié)。本課題研究了Gal及其受體在鏈唑霉素（streptozotocin，STZ）誘導糖尿病大鼠神經病理性疼痛中的作用。
　　 腹膜腔注射STZ(55mg/kg)誘導大鼠發(fā)生糖尿病，建立糖尿病神經性疼痛的模

13、型。Real-timeRT-PCR和Westernblot技術檢測DRG及SDH中Gal、GalR1和GalR2的表達。鞘內注射Gal、Gal拮抗劑M35、選擇性GalR1激動劑M617、選擇性GalR2激動劑AR-M1896，用vonFreyfilaments檢測大鼠觸覺痛覺閾值。
　　 實驗結果如下:
　　 (1)STZ誘導糖尿病大鼠在第4w后可以產生穩(wěn)定的觸覺痛覺閾值下降，至少持續(xù)到第12w。
　　 (2)

14、GalR1的表達在糖尿病大鼠DRG內下降，SDH內不變。
　　 (3)GalR2的表達在糖尿病大鼠DRG和SDH內下降。
　　 (4)外源性Gal可以減輕糖尿病大鼠痛覺過敏，提高觸覺痛覺閾值。Gal拮抗劑M35可以阻斷這種作用。
　　 (5)鞘內注射選擇性GalR1激動劑M617可以提高糖尿病大鼠觸覺痛覺閾值，而GalR2激動劑AR-M1896則未能發(fā)揮作用。
　　 以上結果表明，Gal及其受體系統(tǒng)參與了

15、糖尿病神經病理性疼痛的調節(jié)。通過激活GalR1而不是GalR2可以減輕糖尿病引起的神經病理性疼痛，從而使GalR1可能成為糖尿病神經病理性疼痛的新的潛在治療靶點。糖尿病神經病變中，Gal受體在DRG和或SDH中的表達下降，這種現(xiàn)象可能是糖尿病神經病變中的疼痛和神經損傷的關鍵環(huán)節(jié)。這些結果為進一步研究糖尿病神經病變，開發(fā)新的藥物提供了理論基礎和實驗依據。
　　 第三部分，促生長激素神經肽對糖尿病神經病變大鼠坐骨神經損傷的保護作用<

16、br>　　 糖尿病神經病變能引神經病理性疼痛、周圍神經的損傷以及再生障礙，但引起這些神經病變的機制尚不清楚。本課題的第二部分證實了Gal及其受體參與糖尿病神經病理性疼痛的調節(jié)，本部分將進一步研究探討Gal及其受體在STZ誘導糖尿病大鼠坐骨神經損傷后在神經病理性疼痛和神經再生中的作用。
　　 大鼠STZ誘導糖尿病12w后，與相同年齡正常大鼠隨機分為6組:(1)糖尿病手術+Gal組:糖尿病大鼠坐骨神經夾傷后，每天鞘內注射外源性3μ

17、gGal。(2)糖尿病手術組:糖尿病大鼠坐骨神經夾傷。(3)糖尿病假手術組:糖尿病大鼠假手術，不損傷坐骨神經。(4)正常手術+Gal組:正常大鼠坐骨神經夾傷后，每天鞘內注射外源性3μgGal。(2)正常手術組:正常大鼠坐骨神經夾傷。(3)正常假手術組:正常大鼠假手術，不損傷坐骨神經。檢測各組大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值，觀察各組大鼠趾寬的恢復、神經傳導速度(nerveconductionvelocity,NCV)和坐骨神經形態(tài)學的變化，

18、檢測各組大鼠DRG和SDH內Gal、GalR1和GalR2的表達。
　　 實驗結果如下:
　　 (1)坐骨神經夾傷可加重糖尿病大鼠神經病理性疼痛，使觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值下降。
　　 (2)外源性Gal可顯著減輕糖尿病和正常大鼠坐骨神經夾傷引起的神經病理性疼痛，提高大鼠的觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值。
　　 (3)外源性Gal可顯著改善糖尿病和正常大鼠的趾寬、NCV，促進坐骨神經再生。
　　 (4)

19、DRG和SDH內Gal、GalR1和GalR2的表達在各種不同的實驗條件下具有可塑性。
　　 以上結果表明，Gal及其受體系統(tǒng)參與了糖尿病神經病變的病理發(fā)生過程。在DRG和SDH中，內源性Gal、GalR1和GalR2在糖尿病神經病變大鼠的坐骨神經夾傷后的表達變化與糖尿病神經病變的病理發(fā)生進程有一定的關系。外源性Gal可以明顯改善糖尿病神經病變大鼠坐骨神經損傷后的痛覺過敏狀態(tài)、NCV，加速趾寬恢復，促進坐骨神經再生。本課題為進一