非外源性基因干擾誘導表皮細胞去分化及再生汗腺的臨床研究.pdf

1、目的： 1.體內(nèi)和體外建立表皮細胞去分化模型，檢測與去分化有關的信號通路，確定調(diào)控該過程的關鍵蛋白，為進一步探明表皮細胞去分化發(fā)生機制提供理論基礎； 2.體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺細胞分化，并利用干細胞移植技術促進體內(nèi)損傷汗腺的修復與再生。 方法： 1.將去除基底干細胞層的人表皮片移植到全層皮膚切割傷BALB/c裸鼠皮下，分別于移植后3d、5d和7d取出移植皮片，采用免疫組織化學法、流式細胞檢測、We

2、stern bloting和RT-PCR法檢測移植皮片表型的改變。同樣方法處理瘢痕皮片和角膜上皮，通過免疫組織化學染色觀察二者表型的改變。 2.離體條件下選擇熱和bFGF作為誘導因素處理成熟表皮細胞。采用細胞化學染色、流式細胞檢測和Western bloting觀察細胞表型的改變；通過Giemsa染色和電鏡檢測觀察細胞形態(tài)的改變；通過二維和滋養(yǎng)層培養(yǎng)體系觀察細胞的增殖能力，包括克隆形成和復層生長情況；采用器官培養(yǎng)體系體外構建三維

3、皮膚觀察細胞再分化形成表皮情況；應用基因芯片技術觀察細胞基因表達的改變。用β-粘連蛋白(β-catenin)激動劑處理細胞觀察細胞表型和增殖能力的改變；通過siRNA抑制β-catenin的表達觀察其對表皮細胞去分化過程的影響；利用Smad4敲除小鼠間接激活表皮細胞β-catenin，并觀察CK14和Ki67在表皮組織內(nèi)的表達情況。 3.體外分離、培養(yǎng)和鑒定人成體骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)和人汗腺細胞(SGCs)；分別用Brd

4、U或綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)標記MSCs；將融合的SGCs經(jīng)47℃高溫處理造成體外熱損傷休克模型，再加入標記的MSCs共同培養(yǎng)，5d后，檢測MSCs表型的改變；將具有汗腺表型的干細胞局部移植于裸鼠燙傷腳掌觀察汗腺組織再生修復情況，結合碘-淀粉發(fā)汗實驗檢測汗腺功能以判定治療效果；選擇一例燒傷自愿患者，該患者雙上臂背側均有相似的瘢痕，經(jīng)發(fā)汗實驗證明無汗液分泌。經(jīng)倫理委員會批準和知情同意條件

5、下，抽取其骨髓和切取小塊正常皮膚分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞和汗腺細胞進行共培養(yǎng)，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞獲得汗腺細胞表型，通過自行設計的方案將該細胞種植于右側切除瘢痕處。創(chuàng)面愈合后實驗側行發(fā)汗實驗、汗液成份分析以及組織學檢查。 結果： 1.去基底細胞層處理的表皮片干細胞標志物CK19和β1整合素染色陰性；移植后5d，存活皮片CK19和β1整合素染色呈多層分布，而不是正常表皮中的單層分布。流式細胞儀檢測結果顯示，表皮片移植后CK

6、19陽性細胞和β1整合素陽性細胞分別由移植前的0.00％和0.00％增加到7.54％和5.24％，而CK10陽性細胞由99.62％下降為86.56％。Western bloting和PCR檢測也證實CK19和β1整合素蛋白水平和mRNA水平表達在移植后明顯增強。免疫組化染色顯示，去除干細胞的瘢痕表皮和角膜上皮在移植后有大量干細胞標志物CK19、β1整合素和CK14、CK5陽性細胞的分布。 2.經(jīng)熱和bFGF誘導后的表皮細胞出現(xiàn)蛋

7、白、形態(tài)、功能和基因水平的改變。免疫細胞化學檢測顯示細胞誘導后CK19和β1整合素染色呈陽性；流式細胞儀檢測結果顯示CK19和β1整合素陽性率在誘導前分別為0.00％和0.00％，誘導后7d和14d CK19陽性率增加到83.01％和90.42％，β1整合素陽性率增加到83.63％和93.88％；Western bloting檢測顯示，表皮細胞在去分化誘導前CK19和β1整合素均無表達，誘導后7d和14d CK19和β1整合素出現(xiàn)不同程

8、度的表達。Giemsa染色和透射電鏡觀察顯示細胞誘導后形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為體積減小，細胞器數(shù)目減少，核漿比增大。增殖和再分化能力的改變體現(xiàn)在誘導后的表皮細胞能形成克隆，在滋養(yǎng)層培養(yǎng)條件下可以形成復層生長，并能夠在體外構建出包括基底層和基底上層在內(nèi)的表皮結構?；蛩降母淖儽憩F(xiàn)在與角質(zhì)化相關的基因下調(diào)和與有絲分裂相關的基因上調(diào)。 3.體外激活β-catenin通路可以促使表皮細胞表達CK19和β1整合素，克隆形成和進入細胞分裂周期

9、；而通過siRNA抑制β-catenin的表達可以阻斷由熱和bFGF誘導的去分化過程。免疫熒光染色顯示，Smad4敲除小鼠表皮細胞核內(nèi)β-catenin表達增強，CK14和Ki67表達陽性細胞大量多層分布于表皮組織內(nèi)。 4.MSCs和SGCs在體外均呈克隆樣生長；MSCs表達CD29、CD44、CD71、CD105和CD166，不表達造血干細胞標志CD34和CD45，以及汗腺細胞標志CK19和CEA。加入誘導培養(yǎng)基后MSCs可以

10、向骨和脂肪細胞分化；培養(yǎng)的SGCs表達CK19和CEA；SGCs經(jīng)高溫損傷后，大多數(shù)細胞的細胞間連接消失；BrdU或GFP標記的MSCs和損傷的SGCs共培養(yǎng)5d后，部分MSCs表達汗腺細胞標志CK19或CEA；發(fā)汗實驗和形態(tài)學觀察證實將具有汗腺細胞表型的干細胞移植于裸鼠創(chuàng)而后，能顯著促進受損汗腺的修復與再生。人體移植試驗表明，經(jīng)種植誘導的汗腺細胞后，病人創(chuàng)面愈合部位呈現(xiàn)出汗功能，對照部位發(fā)汗實驗陰性，形態(tài)學檢測顯示創(chuàng)部真皮淺層經(jīng)汗腺移

11、植后有大量CEA陽性細胞，結構類似正常汗腺組織。汗液成分分析結果顯示治療處收集的汗液與正常皮膚處收集的汗液具有類似的pH值，滲透壓和化學組分。 結論： 1.在特定損傷環(huán)境和特定因素的誘導下，已分化的表皮細胞可去分化為表皮干細胞或表皮干細胞樣細胞。 2.表皮細胞的去分化過程與β-catenin/Wnt信號通路有關。 3.骨髓間充質(zhì)干細胞可以在體外成功誘導為汗腺細胞，經(jīng)移植后，在創(chuàng)面能形成具有功能的汗腺組織。