人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)分化及向裸鼠移植的研究.pdf

1、目的:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)具有向多種成熟細(xì)胞分化的潛能，如成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞等，其分離、培養(yǎng)較為容易，純度高，且來源豐富，可在體外多次擴(kuò)增，異體移植免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)小。由于UC-MSCs具有以上的優(yōu)點(diǎn)，使其逐漸被研究者所關(guān)注，尤其是在組織的修復(fù)方面，可以將其應(yīng)用于器官、組織的修復(fù)及重建。本實(shí)驗(yàn)通過研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離，在不同條件下的培養(yǎng)及鑒定，得出培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進(jìn)一步通

2、過間接共培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式使其向汗腺細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，將誘導(dǎo)后的UC-MSCs用BrdU進(jìn)行標(biāo)定，移植入裸鼠皮膚，觀察其在裸鼠體內(nèi)的存活及分布狀況。
　　 方法:
　　 1、UC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:獲得無菌足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，剪刀將其剪成3-4cm長(zhǎng)短的臍帶組織段，生理鹽水反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，剪刀將其剪開后鑷子剔除臍帶中的兩條臍動(dòng)脈、一條臍靜脈，以免被血管內(nèi)皮細(xì)胞所污染。用鑷子將臍帶中的沃頓膠組織(Wha

3、rton'sJelly)呈條索狀撕裂下來，剪刀剪成大小約1mm3的沃頓膠組織塊，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，進(jìn)行傳代。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表面抗原表達(dá)情況。
　　 2、UC-MSCs生長(zhǎng)的影響因素及生長(zhǎng)曲線的繪制:用MTT比色法分別檢測(cè)不同胎牛血清濃度在490nm處吸光度值的均數(shù)(OD值)。同樣用MTT比色法分別檢測(cè)當(dāng)種植密度不同時(shí)在490nm處吸光度值的均數(shù)(OD值)。觀察傳代后不同時(shí)期

4、UC-MSCs的生長(zhǎng)情況，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 3、汗腺細(xì)胞(h-SGCs)培養(yǎng):將所取正常全層皮膚，去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小組織塊，用Ⅱ型膠原酶消化法獲得汗腺組織，培養(yǎng)汗腺細(xì)胞(h-SGCs)貼壁生長(zhǎng);大部分汗腺團(tuán)塊貼壁后，進(jìn)行換液，此后3-4天換液一次。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)CEA和CK7表面抗原的表達(dá)情況。
　　 4、UC-MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定:將培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞進(jìn)行47℃水浴造成體外熱休克，通過傳三代

5、(p3)UC-MSCs間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)UC-MSCs分化為有汗腺表型的干細(xì)胞，免疫組化法檢測(cè)CEA和CK7表面抗原的表達(dá)情況。
　　 5、對(duì)誘導(dǎo)后干細(xì)胞進(jìn)行核型分析:將誘導(dǎo)后細(xì)胞加入秋水仙素0.2mg/L一滴，低滲固定消化等處理，進(jìn)行細(xì)胞染色體檢測(cè)。
　　 6、BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定:在傳3代(p3)UC-MSCs中加入BrdU抗原40μg/ml用來標(biāo)記培養(yǎng)基，48h后，可見UC-MSCs生長(zhǎng)良好，懸浮細(xì)胞少，鋪片用免疫組化法

6、檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況。
　　 7、將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行裸鼠移植:將誘導(dǎo)分化后的UC-MSCs進(jìn)行BrdU標(biāo)定，與人脫細(xì)胞異體真皮共同覆蓋在裸鼠缺損皮膚創(chuàng)面上，覆蓋異體裸鼠皮片，打包固定。2周后將包與縫線拆除，1個(gè)月后取活檢，進(jìn)行HE及免疫組化檢測(cè)。移植后連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)鼠3個(gè)月。
　　 結(jié)果:
　　 1、UC-MSCs分離、培養(yǎng)、鑒定:培養(yǎng)3-5d后，已有少量臍帶組織塊周圍爬出成纖維樣細(xì)胞。一周后，可見部分組織塊周圍爬出成

7、纖維樣細(xì)胞，給予換液。之后2-3天給予換液一次，傳1、2代(p1、P2)的UC-MSCs呈長(zhǎng)梭行，形態(tài)均一。培養(yǎng)至傳八代細(xì)胞(P8)，UC-MSCs仍然存活，但生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)開始發(fā)生變化，折光性變得較差，部分細(xì)胞已開始脫壁凋亡。對(duì)分離培養(yǎng)的UC-MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)，提示本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)得到的細(xì)胞為較純化的MSCs。

8、r>　　 2、UC-MSCs生長(zhǎng)的影響因素及生長(zhǎng)曲線的繪制:當(dāng)胎牛血清濃度為10％時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490值最高，細(xì)胞活性好，活細(xì)胞數(shù)量較多。當(dāng)種植密度為105/ml時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490值最高，細(xì)胞活性好，活細(xì)胞數(shù)量較多。繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線包括滯留期、生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期。
　　 3、汗腺細(xì)胞(h-SGCs)培養(yǎng):培養(yǎng)3天后，已有汗腺貼壁，鏡下可見汗腺團(tuán)塊周圍爬出不規(guī)則形細(xì)胞，呈集落狀生長(zhǎng);培養(yǎng)7天后，大部分汗腺團(tuán)塊

9、貼壁，給予換液;12天后，鏡下可見汗腺團(tuán)塊周圍爬滿不規(guī)則細(xì)胞，呈鋪路石樣生長(zhǎng)。
　　 4、UC-MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定:將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)細(xì)胞特異抗原，CEA和CK7包漿染色均為紅棕色，為陽性。
　　 5、對(duì)誘導(dǎo)后干細(xì)胞進(jìn)行核型分析:鏡下隨機(jī)觀察30個(gè)細(xì)胞的染色體，計(jì)數(shù)染色體條數(shù)，結(jié)果染色體數(shù)均為46條，均未見染色體變異。
　　 6、BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定:免疫組化檢測(cè)結(jié)果可見部分細(xì)胞核呈棕黃色。

10、r>　　 7、將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行裸鼠移植:HE染色可見脫細(xì)胞異體真皮中細(xì)胞均勻分布。免疫組化檢測(cè)BrdU抗原表達(dá)情況，可見BrdU標(biāo)定的誘導(dǎo)后干細(xì)胞均勻分布在人脫細(xì)胞異體真皮中。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離，在不同條件下的培養(yǎng)、誘導(dǎo)及鑒定，得出培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進(jìn)一步通過間接共培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式使其向汗腺細(xì)胞分化，將誘導(dǎo)后的UC-MSCs用BrdU進(jìn)行標(biāo)定，移植入裸鼠

11、皮膚，觀察其在裸鼠體內(nèi)的存活及分布狀況，得到以下結(jié)論:
　　 1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)，提示本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)得到的細(xì)胞較純，可以用于實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2、實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)最適宜UC-MSCs生長(zhǎng)的環(huán)境為含10％胎牛血清和90％DMEM(L)的培養(yǎng)液，最適宜UC-MSCs生長(zhǎng)的種植密度為105/ml。UC-MSCs生長(zhǎng)

12、呈現(xiàn)先慢后快再慢的S型曲線，實(shí)驗(yàn)中我們可以發(fā)現(xiàn)P3以內(nèi)的UC-MSCs形態(tài)穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)、代謝旺盛，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 3、經(jīng)鑒定，誘導(dǎo)后干細(xì)胞免疫組化檢測(cè)CEA和CK7表面抗原均為陽性，提示誘導(dǎo)后干細(xì)胞已具備汗腺細(xì)胞表型。
　　 4、染色體檢測(cè)結(jié)果顯示，此間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)方式對(duì)染色體核型無明顯變化，為安全、可靠誘導(dǎo)方式。
　　 5、經(jīng)檢測(cè)，BrdU轉(zhuǎn)染為成功的。
　　 6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí):誘導(dǎo)分化后