表皮干細胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)人表皮細胞向表皮干細胞逆向分化的實驗研究.pdf

1、對燒傷患者行角質(zhì)形成細胞移植用于覆蓋創(chuàng)面的歷史由來已久，如今為了更好的修復(fù)由燒傷等所致的皮膚缺損，闡明創(chuàng)傷修復(fù)過程中的主要機制，人們對表皮干細胞的分化和分布進行了積極的探索。然而，體外培養(yǎng)條件下，表皮干細胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)三維環(huán)境下表皮干細胞的生物學(xué)特性仍有相當不同，表皮干細胞來源及在創(chuàng)傷修復(fù)中細胞的分化機制還遠未闡明：這些在基底層的表皮干細胞為什么源源不斷的分化而不衰竭，他們是如何來進行分化選擇的?隨著對干細胞可塑性的認識，表皮干細

2、胞是否有其它的來源途徑?例如由其它干細胞轉(zhuǎn)化而來或是由已分化的表皮細胞在特定的條件下逆分化而來的結(jié)果?本研究通過體外細胞培養(yǎng)及在體試驗對上述問題進行了初步探討，分析皮膚修復(fù)過程中表皮干細胞增殖、分化及分布的異位性，試圖求證表皮細胞有可能向表皮干細胞方向逆分化的假設(shè)，以期豐富創(chuàng)傷修復(fù)理論。 一、表皮干細胞的體外培養(yǎng)及EGF的誘導(dǎo)：以往人們對表皮干細胞的研究多集中在分離、培養(yǎng)及鑒定等上。要想獲取臨床上需要的干細胞量，代價較為昂貴。表

3、皮干細胞對細胞外基質(zhì)如Ⅳ型膠原有較好的粘附性。為進一步認識表皮干細胞對Ⅳ型膠原的黏附特性，評價重復(fù)利用Ⅳ膠原以差速黏附法在分選表皮干細胞中的效果；同時以EGF誘導(dǎo)干細胞，以期維持干細胞的克隆狀態(tài)，獲取更多得廉價表皮干細胞。選用包皮環(huán)切術(shù)患者包皮作為組織標本，用酶消化法分離表皮細胞，以Ⅳ型分選表皮干細胞，建立表皮干細胞的培養(yǎng)體系，通過免疫組織化學(xué)方法及觀察增殖現(xiàn)象等方法對表皮干細胞進行鑒定；以表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)表皮干細胞增殖和分化

4、，通過表皮干細胞的傳代次數(shù)、流式細胞術(shù)(FCM)檢測傳代后CK19陽性細胞的百分比來分析EGF在減緩表皮干細胞衰老進而在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用；結(jié)果表明：①表皮干細胞對細胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原有良好的黏附特性，在以Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中細胞貼壁多且后期生長良好；②培養(yǎng)基中添加適量的EGF可以促進細胞的增殖和增加傳代次數(shù)； 二、超薄表皮片在體移植試驗：皮片移植是燒傷治療中最常用的手術(shù)方式。臨床上移植的刃厚皮片往往包含基底層及少量的真皮，皮片移

5、植后基底層細胞的分布和分化現(xiàn)象，鮮見有文獻報道。用酶消化法分離包皮環(huán)切術(shù)患者包皮表皮，以熒光示蹤劑DAPI標記經(jīng)預(yù)處理的表皮片，將此超薄表皮片移植于裸鼠創(chuàng)面，分別在第4天和第7天活殺取材，制作HE、石蠟與冰凍切片。用免疫組化的方法評估表達角蛋白19和14細胞的特征和分布。染色顯示：移植的皮片細胞層次有松弛紊亂的跡象，冰凍切片在基底層之外亦見有少量孤立雙染的CK19陽性細胞。這些現(xiàn)象在移植后的第4天最為顯著，但未觀察到孤立成團的“干細胞島

6、”現(xiàn)象。這種特異性細胞的異位可能是維持皮片的活力、參與創(chuàng)面的修復(fù)以及之后表皮重構(gòu)的其始動因素。 三、機械應(yīng)力對皮膚干細胞增殖和分化的影響：皮膚軟組織擴張術(shù)是將皮膚軟組織擴張器經(jīng)手術(shù)植入皮膚軟組織下，通過定期注水使其不斷擴張，使表面的皮膚軟組織逐漸擴展延伸，從而達到修復(fù)皮膚缺損、重建功能及恢復(fù)外貌的目的。目前，對軟組織擴張術(shù)的細胞生物學(xué)機制研究報道不多，大多數(shù)研究僅證實擴張后細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞間距增大，但更深層次的原因如皮膚干

7、細胞的特性有無相應(yīng)性變化?目前尚不清楚。機械應(yīng)力下表皮干細胞的生物學(xué)變化將有助于闡明組織擴張的機制。 本實驗率先對軟組織擴張后人的皮膚(頭皮和頸部皮膚)干細胞進行研究，探討外界機械應(yīng)力是否對皮膚干細胞增殖、分化和分布有影響，為臨床軟組織擴張術(shù)的應(yīng)用提供理論支持。通過病理切片免疫組織化學(xué)染色的方法觀察在機械應(yīng)力等作用下在體皮膚干細胞的增殖、分化和分布特征，結(jié)果顯示擴張后的皮膚可見明顯的CK19陽性細胞細胞增多，初步表明外界機械應(yīng)力