應(yīng)用表皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建復(fù)合皮膚及移植實驗.pdf

1、目的： 采用體外分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，復(fù)合脫細(xì)胞真皮支架體外構(gòu)建復(fù)合皮膚，并移植修復(fù)兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面修復(fù)情況，探討其在全層缺損創(chuàng)面修復(fù)的可行性，為其進一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 取燒傷整形患者植皮手術(shù)剩余皮片標(biāo)本，經(jīng)胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，用Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化人表皮干細(xì)胞，以含表皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液等組成的人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基進行體外

2、培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。均以角質(zhì)細(xì)胞作對照。 取骨髓穿刺所得人健康骨髓，密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。以含20％胎牛血清、低糖DMEM作為培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。 將間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞分別接種于脫細(xì)胞真皮上，體外構(gòu)建復(fù)合皮膚。 在新西蘭白兔背部制作4個全層皮膚缺損模型并隨機分組，分為A、B、C、D四組，A、B、C三組分別用間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮構(gòu)建復(fù)合皮、表

3、皮干細(xì)胞和脫細(xì)胞真皮構(gòu)建復(fù)合皮、脫細(xì)胞真皮，D組空白創(chuàng)面，觀察全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合情況。各組分別于術(shù)后15天和21天在部分創(chuàng)面取材行常規(guī)HE染色，觀察各組創(chuàng)面愈合過程中的組織結(jié)構(gòu)改建情況。 結(jié)果： 1、經(jīng)Ⅳ型膠原籌速粘附法分離、純化的人表皮干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察見細(xì)胞呈明顯克隆性生長并逐漸融合。透射電鏡觀察見細(xì)胞胞核大，胞漿少，核漿比例大，胞漿內(nèi)細(xì)胞器少。 2、利用密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置相差

4、顯微鏡觀察見間充質(zhì)干細(xì)胞呈長梭型生長并逐漸融合成放射狀。透射電鏡觀察見細(xì)胞形態(tài)不一，多位圓形，可見核仁，胞漿比例大，胞質(zhì)內(nèi)有分泌小泡，細(xì)胞器較少，為低分化的幼稚細(xì)胞。 3、用間充質(zhì)干細(xì)胞與表皮干細(xì)胞所構(gòu)建的復(fù)合皮膚、表皮干細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合皮膚、單純真皮移植覆蓋修復(fù)兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面，空白組用油砂布覆蓋。術(shù)后創(chuàng)面愈合時間分別為：14.56±1.06d、16.21±1.32d、18.25±1.16d、23.0±1.37d，組間比較差

5、異有顯著性意義（P<0.05）。常規(guī)HE染色觀察創(chuàng)面的改建情況顯示：（1）A、B兩組創(chuàng)面15d后，可見創(chuàng)面已上皮化，細(xì)胞分層明顯，術(shù)后21d后兩組創(chuàng)面膠原排列趨于規(guī)則，而C、D兩組創(chuàng)面15d后創(chuàng)面上皮化不明顯，可見許多炎性細(xì)胞，21d創(chuàng)面表皮層上皮化不如A、B兩組；（2）同一時間比較，含有間充質(zhì)干細(xì)胞的A組創(chuàng)面見許多毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，肉芽組織形成豐富，較其他組創(chuàng)面新生血管明顯。 結(jié)論： 利用Ⅳ型膠原差速粘附法