應用表皮干細胞及脫細胞真皮構(gòu)建組織工程皮膚及其移植實驗研究.pdf

1、創(chuàng)(燒)傷等多種原因造成的皮膚大面積缺損可導致嚴重的機體功能障礙甚至危及生命。目前修復皮膚缺損的方法主要是用自體皮膚移植。但在治療大面積深度燒傷等皮膚缺損時，由于缺乏供皮區(qū)，皮源不足，往往給創(chuàng)面覆蓋造成困難。為反復供皮的需要，目前臨床應用的植皮術(shù)，諸如郵票狀植皮術(shù)、網(wǎng)狀皮膚植皮術(shù)、異體皮嵌植自體小皮片混合移植術(shù)、微粒皮移植術(shù)以及自體表皮細胞培養(yǎng)移植術(shù)等方法，均不同程度地缺乏真皮成分，因而不能滿意解決愈后外觀和功能問題。然而如果增加供皮的

2、厚度，勢必會影響供皮區(qū)的正常愈合。為解決這一難題，目前用組織工程學方法研制了許多皮膚代用品，但臨床效果尚不穩(wěn)定。因此，構(gòu)建一種功能理想的永久性皮膚替代品具有很重要的臨床意義和應用價值。 目的 利用組織工程學原理，我們期望通過體外分離擴增人表皮干細胞作為種子細胞，自行制備異種(豬)脫細胞真皮支架作為基質(zhì)材料h探討體外構(gòu)建組織工程皮膚的可行性。并將該組織工程皮膚移植于動物創(chuàng)面，探討該組織工程皮膚修復全層皮膚缺損的可行性。 方

3、法 通過酶消化法，分離小兒包皮的表皮與真皮層，表皮制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10<'6>／ml，接種于包被好Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中快速粘附10～15min(37℃)，棄去未粘附細胞，保留快速粘附細胞繼續(xù)培養(yǎng)。以高糖低鈣的DMEM培養(yǎng)基，補充100g／L的干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清(FBS)，0.05mmol／L CaCl<,2>，10ng/ml表皮生長因子，10<'-6>mol／L氫化可的松進行培養(yǎng)。對傳代后擬接種的種子細胞進行流式細胞

4、儀α<,6>、CD<,71>表型鑒定，角蛋白19免疫細胞化學染色鑒定以及形態(tài)學觀察等。我們以NaCl-SDS-胰蛋白酶法制備脫細胞真皮，并進行組織學觀察。將分離培養(yǎng)傳代的表皮干細胞接種于鋪好Ⅳ型膠原的脫細胞真皮表面，加入干細胞培養(yǎng)體系，先置于培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，再行氣液界面培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚。對構(gòu)建的組織工程皮膚進行組織學觀察。將構(gòu)建的組織工程皮膚移植于大鼠全層創(chuàng)面，以單純脫細胞真皮移植作對照。對移植后創(chuàng)面進行大體觀察、組織學觀察、抗人HL

5、A—I免疫熒光染色及廣譜角蛋白染色。 結(jié)果1、黏附的細胞接種在已包被好Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中后很快貼壁，第3-4d形成一些小集落。其后細胞逐漸增殖，至第1Od左右逐漸有大集落形成。而未黏附的細胞貼壁遲，整個生長過程中未見大集落形成。黏附細胞K<,19>免疫化學染色陽性，α<,6><'bri>CD<,71><,dim>細胞占細胞總數(shù)的40％左右。黏附細胞具有表皮干細胞特性。2、制備的無細胞異種真皮呈乳白色，柔軟而有彈性，光鏡下見表皮完

6、全去除，真皮內(nèi)無任何細胞成分，未見細胞碎屑、毛囊、汗腺或血管結(jié)構(gòu)。膠原纖維結(jié)構(gòu)保存完好，排列有序。3、表皮干細胞種植于脫細胞真皮上后，細胞便迅速貼壁。體外聯(lián)合培養(yǎng)約兩周后，可融合形成復合皮。復合皮H E染色，光鏡下可見組織工程皮底層為規(guī)則的纖維結(jié)構(gòu)，脫細胞真皮表面覆蓋多層融合的表皮層細胞結(jié)構(gòu)，細胞間連接緊密。表皮層結(jié)構(gòu)與脫細胞真皮基底黏附牢。4、復合皮移植于大鼠創(chuàng)面后，皮片愈合良好，未見排斥反應，無色素沉著，創(chuàng)面略有收縮；移植后4周，創(chuàng)

7、面切片光鏡下見表皮層含多層細胞結(jié)構(gòu)，創(chuàng)面愈合，膠原排列整齊，真皮組織內(nèi)見少許炎性細胞浸潤。組織工程皮膚移植組抗人HLA—I免疫熒光染色，表現(xiàn)為陽性反應，說明組織工程皮膚移植后創(chuàng)面愈合的表皮細胞層結(jié)構(gòu)來源于復合皮中接種的細胞。組織工程皮移植組廣譜角蛋白染色見表皮全層結(jié)構(gòu)內(nèi)胞漿染成棕黃色，成陽性反應，說明復合皮移植后創(chuàng)面被覆一表皮層結(jié)構(gòu)，創(chuàng)面愈合。脫細胞真皮組始終無表皮結(jié)構(gòu)形成，表面逐漸干燥、變硬，周邊翹起；最終與創(chuàng)面脫離而創(chuàng)面暴露，至4周

8、時創(chuàng)面仍未愈合。脫細胞真皮移植組術(shù)后兩周，光鏡下未見表皮層結(jié)構(gòu)形成，創(chuàng)面處可見炎性細胞浸潤，創(chuàng)面未愈合。脫細胞真皮移植組抗人H L A—I免疫熒光染色反應陰性。 結(jié)論1、我們采用NaCl-SDS-胰蛋白酶法制備的脫細胞真皮，可完全去除表皮層及真皮內(nèi)各種細胞成分，膠原纖維結(jié)構(gòu)保存完好，無斷裂，排列有序。 2、Ⅳ型膠原差速黏附法可用來分選和純化表皮干細胞。以Ⅳ型膠原鋪底，輔以高糖低鈣的DMEM培養(yǎng)基，以及適合干細胞生長的專用