一種新的萘酚類衍生物1-羥基-2-萘甲酸甲酯的抗炎作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥是機(jī)體組織對(duì)損傷性刺激的一種防御性反應(yīng)，它是一個(gè)由多細(xì)胞（比如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）、多成分（細(xì)胞因子，血管活性物質(zhì)、趨化因子、粘附因子、炎癥相關(guān)酶類）參與的復(fù)雜的過程。在炎癥過程中，一方面損傷因子直接或間接造成組織和細(xì)胞的破壞，另一方面通過炎癥充血和滲出反應(yīng)，以稀釋、殺傷和包圍損傷因子。同時(shí)通過實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的再生使受損的組織得以修復(fù)和愈合。因此炎癥是損傷和抗損傷的統(tǒng)一過程。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對(duì)人體抵抗損傷、清除感染

2、，促進(jìn)傷口的愈合是有益的，然而過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致持久性的組織損傷，進(jìn)而影響我們的身體健康。
　　 巨噬細(xì)胞是由血液中單核細(xì)胞遷入組織后分化而成的，它在不同器官、組織中均有分布，例如:肺中的肺泡巨噬細(xì)胞、肝臟中的枯否氏細(xì)胞、神經(jīng)組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及骨組織中的蝕骨細(xì)胞等等。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的一種免疫細(xì)胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用。同時(shí)它又是體內(nèi)啟動(dòng)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中心細(xì)胞。巨噬細(xì)胞能夠被多種炎癥性刺激所激活，其中就

3、包括作用較強(qiáng)的細(xì)菌脂多糖。細(xì)菌脂多糖又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細(xì)菌致病的主要因素，具有較強(qiáng)激活單核巨噬細(xì)胞的作用。當(dāng)革蘭氏陰性細(xì)菌在死亡或進(jìn)行繁殖時(shí)釋放出來的LPS進(jìn)人宿主體內(nèi)，可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì)，諸如:NO、前列腺素PGs以及促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的可以出現(xiàn)中毒性休克，全身炎癥反應(yīng)綜合征以及多器官功能衰竭等。巨噬細(xì)胞及其釋放的炎癥介質(zhì)在炎癥過程中扮演了一

4、個(gè)重要的角色。目前研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞參與了多種炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，例如，動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、敗血癥等。
　　 NO是一種毒性較強(qiáng)的氣體自由基，其在體內(nèi)由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)催化左旋精氨酸而產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)功能。NO是重要的細(xì)胞信號(hào)分子，同時(shí)還參與神經(jīng)信息傳遞、心肺功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡以及免疫防御等多個(gè)過程。目前已知的NOS有神經(jīng)型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS

5、(eNOS)及誘生型NOS(iNOS)，前兩者又稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)，由cNOS催化生成的NO濃度很低，主要參與生理過程，維持細(xì)胞的正常功能。而巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO濃度高，主要由誘導(dǎo)性一氧化氮合酶催化產(chǎn)生。短期、大量的NO釋放使巨噬細(xì)胞具有殺傷微生物以及腫瘤細(xì)胞的作用，然而長(zhǎng)期、過度的NO會(huì)通過DNA損傷、線粒體呼吸抑制、活性氮等細(xì)胞毒性效應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞和組織的損傷，進(jìn)而參與某些炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，抑制NO的過量表達(dá)已經(jīng)成為

6、預(yù)防炎癥反應(yīng)和疾病的研究熱點(diǎn)。
　　 前列腺素(prostaglandins，PGS)是廣泛存在于動(dòng)物和人體內(nèi)的一組重要的組織激素，不僅對(duì)心血管、胃腸道、呼吸和生殖系統(tǒng)的功能有強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用，而且還是炎癥、發(fā)熱及疼痛發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素的關(guān)鍵酶，包括COX-1、COX-2和COX-3三種亞型。COX-1和COX-3為結(jié)構(gòu)型環(huán)氧化酶，主要存在于血管、

7、胃、腎等組織中，參與血管舒縮、血小板聚集、胃粘膜血流、胃黏液分泌及腎功能等的調(diào)節(jié)，其功能與保護(hù)胃腸黏膜、調(diào)節(jié)血小板聚集、調(diào)節(jié)外周血管的阻力和調(diào)節(jié)腎血流量分布有關(guān)。COX-2為誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，在正常組織中幾乎不表達(dá)，但在活化的巨噬細(xì)胞中卻誘導(dǎo)性地大量表達(dá)。傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥例如阿司匹林、羅非昔布等通過抑制環(huán)氧化酶的活性，減少了前列腺素的產(chǎn)生，進(jìn)而具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎的作用。這一類藥物已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他炎癥性疾病當(dāng)中。<

8、br>　　 TNF-α、IL-1β以及IL-6均是促炎性細(xì)胞因子，它們可以直接激活免疫效應(yīng)細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等），也可以旁分泌或自分泌的形式促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。正常水平的TNF-α、IL-1β以及IL-6對(duì)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗感染、促進(jìn)組織修復(fù)、引起腫瘤細(xì)胞凋亡等至關(guān)重要，然而促炎性細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡，引起過度的炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥性疾病的發(fā)生。例如，某些炎癥性疾病如

9、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血液循環(huán)當(dāng)中的促炎性細(xì)胞因子就有不同程度的增加，其水平與疾病的嚴(yán)重程度往往具有一定的相關(guān)性。而且通過使用單克隆抗體或受體拮抗劑阻斷促炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的效應(yīng)，在治療某些炎癥性疾病上已取得了良好的治療效果。
　　 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生上述炎癥介質(zhì)是通過復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活而實(shí)現(xiàn)的，其中與巨噬細(xì)胞炎癥基因和蛋白表達(dá)關(guān)系最密切的是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和有絲分裂原蛋白激酶MAPKs.
　　 NF-κB(nuclea

10、rfactor-κB)是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，它能夠參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化與凋亡及其它應(yīng)激反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，NF-κB通常以p50/p65異源二聚體形式存在。當(dāng)細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-kB與其抑制性蛋白IκB結(jié)合，并以三聚體的無活性形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到外來刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化并被降解，NF-κB被解除抑制從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并與靶基因上游調(diào)控序列結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)

11、基因的轉(zhuǎn)錄。NF-kB的激活主要是通過IκB的降解來調(diào)節(jié)的，然而越來越多的研究表明:NF-kB的活性調(diào)節(jié)還可以通過NF-kB蛋白的磷酸化和乙酞化等直接修飾作用來實(shí)現(xiàn)。例如酪蛋白激酶Ⅱ能夠通過磷酸化p65亞基的529位絲氨酸殘基，增強(qiáng)NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路是LPS所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中最重要的下游通路。也是巨噬細(xì)胞激活的中心環(huán)節(jié)。當(dāng)巨噬細(xì)胞NF-κB被激活后，可迅速誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子、粘附分子、趨化分子

12、以及炎癥相關(guān)酶類的表達(dá)。如TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2等。因此阻斷NF-κB信號(hào)通路的活化，可以減少多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎的作用。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸和（或）蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)通路，在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞增殖及參與調(diào)控體內(nèi)多種物質(zhì)代謝過程中起著重要作用。

13、MAPKs家族有三條經(jīng)典的亞族通路，分別是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularSignal-regulatedkinases1/2，ERKI/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38Mitogen-ActivatedProteinKinases，p38-MApK)。MAPKs的激活（主要是通過磷酸化）是LPS作用于單核/巨噬細(xì)胞后發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)早期

14、事件之一，而且MAPKs的底物多為核轉(zhuǎn)錄因子，其中就包括NF-κB、AP-1等，因此MAPKs與炎性細(xì)胞因子的合成和分泌密切相關(guān)。
　　 巨噬細(xì)胞激活及其釋放的炎癥介質(zhì)在炎癥性疾病當(dāng)中發(fā)揮了重要的作用，因此抑制活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)已經(jīng)成為抗炎藥物治療和研究的靶點(diǎn)。而且更讓人關(guān)注的是:以抑制巨噬細(xì)胞激活和抑制巨噬細(xì)胞過度釋放炎癥介質(zhì)為靶點(diǎn)的這類抗炎藥物，與傳統(tǒng)的抗炎藥物相比在理論有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
　　 在我國(guó)，抗炎藥

15、物是僅次于抗感染藥物的第二大類藥物。目前的抗炎免疫藥物主要分為三大類，即甾體類抗炎藥和非甾體類抗炎藥(NSAIDs)以及疾病調(diào)修藥，三類抗炎免疫藥物在臨床上已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用。甾體類抗炎藥主要有糖皮質(zhì)激素類藥物如地塞米松等，具有廣泛的生理和藥理作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用有引起物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂，誘發(fā)或加重感染，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等毒副作用;非甾體類抗炎藥物主要是通過抑制COX進(jìn)而抑制前列腺素(PGs)的產(chǎn)生，而發(fā)揮抗炎作用。可細(xì)分為非選擇性COX抑制

16、劑（如阿司匹林）以及選擇性COX-2抑制劑（如塞來昔布）等，非選擇性COX抑制劑因?yàn)檫x擇性低，所以會(huì)引起很多的毒副反應(yīng)，選擇性COX-2抑制劑毒副作用少，然而隨著研究發(fā)現(xiàn)COX-2在大腦、精囊及腎臟中也存在結(jié)構(gòu)型表達(dá)，如果抑制這些組織中的COX-2活性會(huì)產(chǎn)生哪些負(fù)面的影響，需要引起大家進(jìn)一步的重視。疾病調(diào)修藥包括免疫抑制劑、免疫增強(qiáng)劑以及免疫調(diào)節(jié)劑，這類藥物對(duì)免疫功能有抑制或增強(qiáng)或雙向調(diào)節(jié)的作用。例如、雷帕霉素以及來氟米特等具有抑制免疫

17、反應(yīng)的作用，主要用于器官移植的抗排斥反應(yīng);左旋咪唑作為免疫促進(jìn)劑主要用于自身免疫性疾病的治療，還可作為腫瘤治療的輔助用藥等。
　　 隨著抗炎免疫藥理學(xué)研究的不斷深入以及人們?cè)谘装Y反應(yīng)細(xì)胞分子機(jī)制方面取得的研究進(jìn)展，迫切需要我們尋找更多抗炎效果好、毒副作用少，能夠長(zhǎng)期應(yīng)用的抗炎藥物。然而抑制巨噬細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)就是一個(gè)非常好的以細(xì)胞為整體的藥物研究靶點(diǎn)。
　　 萘酚類衍生物是一類在萘環(huán)上含有羥基的化合物，它們作為

18、原料藥在醫(yī)藥與工業(yè)行業(yè)當(dāng)中被廣泛地應(yīng)用。整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn):萘酚類衍生物的研究文獻(xiàn)主要集中在化學(xué)層面、而有關(guān)其活性方面的文章并不多?，F(xiàn)有已經(jīng)報(bào)道的萘酚類衍生物活性主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:抗細(xì)菌和真菌的活性;干擾糖的無氧酵解;促進(jìn)膽汁分泌、抗腫瘤活性以及抗炎活性。鑒于萘酚類衍生物結(jié)構(gòu)與功能的多樣性，這類化合物的抗炎活性尤為讓人關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)2-取代-1-萘酚類衍生物具有抑制環(huán)氧化酶和脂氧合酶的作用。1,4-二羥基萘甲酸具有抑制骨吸收以及DSS誘

19、導(dǎo)結(jié)腸炎的作用。
　　 基于上述研究背景，我們準(zhǔn)備以脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型以及酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎模型，對(duì)萘酚類衍生物1-羥基2-萘甲酸甲酯(Methyl-1-hydroxy-2-naphthoate，MHNA)的體內(nèi)外的抗炎活性及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了深入的探討。
　　 主要研究方法和結(jié)果分為三個(gè)部分:
　　 一、MHNA抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　 1、MHNA對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力沒

20、有明顯影響。
　　 采用MTT法首先分析0-40μg/ml濃度范圍內(nèi)的MHNA對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。MHNA在劑量達(dá)到40μg/ml濃度與巨噬細(xì)胞RAW264.7作用24h時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞活力沒有明顯影響（差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。因此本研究選取的MHNA最大劑量10μg/ml對(duì)巨噬細(xì)胞是安全的。
　　 2、MHNA抑制LPS激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、IL-1β以及IL-6。
　　 以2.5、5.0、10.0μ

21、g/mlMHNA以及0.1μg/ml的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24h。留取細(xì)胞上清。用Griess試劑法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的NO，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥細(xì)胞因子TNF-a，IL-1β以及IL-6飛水平。基礎(chǔ)水平的NO濃度在2.69±0.39μM.，100μg/ml的LPS作用24h巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的濃度達(dá)到了21.78±1.24μM。MHNA在2.5-10μg/ml濃度范圍內(nèi)明顯抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO。而且MHN

22、A劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)地IL-1β以及IL-6的產(chǎn)生。然而它對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-a的影響相對(duì)較小，只在高濃度10μg/ml才有輕微地抑制作用，且統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異。
　　 3、MHNA抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS及COX-2蛋白的表達(dá)
　　 以2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA以及0.1μg/ml的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24h。提取細(xì)胞總蛋白，用westernblot方法探討MHNA對(duì)巨噬細(xì)

23、胞激活后誘導(dǎo)性酶iNOS及COX-2表達(dá)的影響。結(jié)果表明，MHNA顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS及COX-2蛋白的表達(dá)。
　　 4、MHNA抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥基因的表達(dá)
　　 以2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA以及終濃度為0.1μg/ml的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞6h，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，采用realtime-PCR方法，檢測(cè)細(xì)胞炎癥基因iNOS，COX-2，IL-1β以及IL-

24、6mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，MHNA對(duì)1ps誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥基因iNOS，COX-2，IL-1β以及IL-6mRNA的表達(dá)有明顯地抑制作用。
　　 二、MHNA體內(nèi)抗炎活性的研究
　　 1、MHNA抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹
　　 為了探討MHNA對(duì)急性炎癥滲出的影響，我們構(gòu)建了二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹模型。結(jié)果表明，MHNA20、40、80mg/kg的劑量灌胃給藥，對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有明顯的抑制作用

25、(P＜0.05)，且呈明顯的量效關(guān)系，抑制率分別為17.8％、29.5％，45.0％。
　　 2、MHNA減輕腹膜炎小鼠腹腔中蛋白與白細(xì)胞的滲出。
　　 為了進(jìn)一步探討MHNA的體內(nèi)抗炎活性，我們構(gòu)建了酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎模型。研究表明:酵母多糖可以迅速誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)，引起小鼠腹腔灌洗液中出現(xiàn)大量的蛋白與白細(xì)胞。地塞米松10mg/kg以及MHNA40mg/kg，MHNA80mg/kg能顯著性抑制腹腔中蛋白的滲出（抑

26、制率分別是:45.9％，19.3％以及29.4％），而且還能抑制白細(xì)胞的浸潤(rùn)（抑制率分別是:57.4％，22.5％以及38.6％）。
　　 3、MHNA抑制腹膜炎小鼠腹腔中炎癥細(xì)胞因子IL-6的水平
　　 為了探討MHNA對(duì)酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠腹腔中炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，我們檢測(cè)了小鼠腹腔灌洗液中細(xì)胞因子IL-6的水平。研究結(jié)果表明:正常的小鼠腹腔中幾乎檢測(cè)不出IL-6，但是腹腔注射酵母多糖后6h，腹腔IL-6水平

27、明顯增高。地塞米松10mg/kg以及MHNA40mg/kg，MHNA80mg/kg顯著性抑制腹腔中IL-6的產(chǎn)生（抑制率分別是:48.7％，19.5％以及41.2％）。
　　 三、MHNA抗炎作用機(jī)制的探討
　　 1、MHNA抑制巨噬細(xì)胞NF-κB的激活
　　 為了探討MHNA抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，我們分別用westernblot方法，報(bào)告基因方法，以及凝膠遷移實(shí)驗(yàn)探討了MHNA對(duì)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子N

28、F-κB激活的影響。RAW264.7細(xì)胞先與2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA作用1h，然后再與0.1μg/ml的LPS作用30min（免疫印跡法檢測(cè)iκB降解以及MAPKs的磷酸化）或1h（提取胞漿胞核蛋白，免疫印跡法檢測(cè)胞漿胞核中NF-κB的分布，凝膠遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB與DNA的結(jié)合能力）Westernblot結(jié)果顯示:與未刺激的對(duì)照細(xì)胞相比，脂多糖刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)iκB降解明顯，胞漿內(nèi)NF-κB減少，胞核內(nèi)NF-

29、κB增多，表明脂多糖刺激可以誘導(dǎo)NF-κB由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。MHNA與脂多糖一起作用，明顯減弱了脂多糖引起的iκB降解、胞漿內(nèi)NF-κB減少以及胞核內(nèi)NF-κB增多的這一作用。
　　 報(bào)告基因結(jié)果顯示:0.1μg/ml脂多糖引起巨噬細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性（反映為報(bào)告基因最后檢測(cè)的相對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱）相比對(duì)照細(xì)胞提高了5.3倍，而MHNA對(duì)巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性有明顯地抑制。
　　 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)EMSA結(jié)果顯示:脂多糖引起巨

30、噬細(xì)胞NF-κB與其特異性結(jié)合的DNA序列結(jié)合能力增加，MHNA或NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082預(yù)處理巨噬細(xì)胞1h，均可以抑制脂多糖引起的NF-κB與DNA結(jié)合能力的增強(qiáng)。
　　 2、MHNA抑制巨噬細(xì)胞MAPKs的激活
　　 RAW264.7細(xì)胞先與2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA作用1h，然后再與0.1μg/ml的LPS作用30min，提取細(xì)胞總蛋白，免疫印跡法檢測(cè)MAPKs(p38MAPK，

31、ERK1/2，以及JNK)的磷酸化。結(jié)果表明:脂多糖可以引起巨噬細(xì)胞p38MAPK，ERK1/2，以及JNK的磷酸化增加，而對(duì)總的p38MAPK,ERK1/2，以及JNK的蛋白水平?jīng)]有明顯影響。2.5-10.0μg/ml的MHNA劑量依賴性地抑制p38MAPK以及JNK的磷酸化，而對(duì)ERK1/2的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。
　　 結(jié)論:
　　 一、本文首次發(fā)現(xiàn)，MHNA具有抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。具體表現(xiàn)為

32、:
　　 1、MHNA抑制激活的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)NO、IL-1β以及IL-6的產(chǎn)生;
　　 2、MHNA抑制激活的巨噬細(xì)胞iNOS與COX-2蛋白的表達(dá);
　　 3、MHNA抑制激活的巨噬細(xì)胞炎癥基因(iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6)的表達(dá)。
　　 二、MHNA具有良好的體內(nèi)抗炎活性。具體表現(xiàn)為:
　　 1、MHNA抑制了二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹
　　 2、MHNA減輕了酵母多

33、糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠腹腔中蛋白與白細(xì)胞的滲出。
　　 3、MHNA抑制了酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠腹腔中炎癥細(xì)胞因子IL-6的水平。
　　 三、MHNA通過抑制巨噬細(xì)胞NF-κB、p38MAPK以及JNK信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　 綜上所述:MHNA通過阻斷NF-κB、p38MAPK以及JNK信號(hào)通路的活化，抑制了巨噬細(xì)胞的激活，減少了巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥