2-（α-羥基戊基）苯甲酸鉀鹽對癡呆動物模型的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽(Potassium2-(1-hydroxypentyl)-benzoate，dl-PHPB)是本所設(shè)計(jì)合成的新化合物，它是丁基苯酞(3-n-butylphthalide，dl-NBP)的前藥。dl-NBP是一類抗缺血性腦卒中新藥，對缺血腦組織具有多種神經(jīng)保護(hù)作用。推測，dl-NBP可能通過神經(jīng)保護(hù)作用對老年癡呆有治療作用。但是，dl-NBP在開發(fā)過程中存在一些缺點(diǎn)。dl-PHPB是針對它的缺點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的丁

2、基苯酞內(nèi)酯環(huán)開環(huán)的產(chǎn)物，具有多方面的優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)。本研究中，我們采用三種公認(rèn)的老年癡呆模型觀察了dl-PHPB對癡呆動物認(rèn)知缺陷的改善作用，并探討了其可能的作用機(jī)制。 1.dl-PHPB對腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及其機(jī)制 采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的方法制備大鼠腦低灌注模型(2-VO大鼠)，用Morris水迷宮檢測dl-PHPB給藥3周對動物近記憶和空間辨別力的影響。結(jié)果顯示：dl-PHPB39、129mg/kg、

3、dl-NBP100mg/kg和吡拉西坦600mg/kg可不同程度地縮短癡呆大鼠的潛伏期。dl-PHPB39mg/kg組采取直線式、趨向式策略的次數(shù)明顯多于溶劑對照組，其它各藥各劑量組也有改善搜索策略的趨勢。平臺探索實(shí)驗(yàn)中，除dl-PHPB129mg/kg和dl-NBP100mg/kg外，各給藥組大鼠在目標(biāo)象限的活動時(shí)間明顯長于溶劑對照組，尤其dl-PHPB39mg/kg組。同時(shí)，dl-PHPB39mg/kg組的第一次穿越目標(biāo)時(shí)間顯著短于

4、溶劑對照組。表明，dl-PHPB可明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶和探索行為，尤其中、大劑量。 生化測定結(jié)果顯示：2-V0大鼠1個(gè)月后，海馬ChAT活力下降趨勢明顯。dl-PHPB129mg/kg能顯著提高海馬ChAT活力，dl-PHPB39mg/kg、吡拉西坦600mg/kg也有升高的趨勢。 生化法測定抗氧化作用證明：dl-PHPB13、39mg/kg、dl-NBP100mg/kg和吡拉西坦600mg/kg可明顯降低皮層SOD活

5、力。除吡拉西坦外，各給藥組有降低皮層CAT活力的趨勢。GSH-Px活力在各組腦組織間沒有明顯差異。dl-PHPB三個(gè)劑量和dl-NBP100mg/kg顯著降低皮層MDA含量。各組間海馬SOD活力和MDA含量沒有明顯差異。另外，生化測定還顯示，各組之間腦組織ATP酶活力、LD和NO含量沒有顯著性差異。 用HE染色進(jìn)行腦組織形態(tài)研究，結(jié)果顯示，dl-PHPB三個(gè)劑量可不同程度地改善皮層和海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常，尤以39m

6、g/kg作用顯著。K-B染色發(fā)現(xiàn)，該藥三個(gè)劑量對胼胝體和視束的病理改變也有不同程度的改善作用，其中39mg/kg作用最強(qiáng)。 用免疫組化方法對腦組織進(jìn)行染色。在皮層，溶劑對照組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)有增多的趨勢，而各給藥組該指標(biāo)明顯小于溶劑對照組，尤其dl-PHPB39mg/kg組。在海馬，各給藥組的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯小于溶劑對照組。在胼胝體，dl-PHPB39mg/kg組該指標(biāo)小于溶劑對照組。在視束，dl-PHPB39、129m

7、g/kg、dl-NBP100mg/kg以及吡拉西坦600mg/kg組的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于溶劑對照組。說明，dl-PHPB可明顯減少2-VO大鼠腦組織活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，尤其在海馬和視束。 采用免疫組化法在皮層和海馬CA1區(qū)證實(shí)，dl-PHPB39mg/kg可明顯增高M(jìn)AP2的分布面積，該藥13、129mg/kg及dl-NBP100mg/kg則僅有增高的趨勢。各藥對皮層和海馬MAP2的密度沒有明顯影響。 大鼠腦低灌

8、注后BDNF免疫組化染色顯示，在皮層和海馬，各組間染色面積無明顯差異。但從染色密度看，在皮層，dl-PHPB可增加BDNF的表達(dá)，其中39mg/kg作用最強(qiáng)；在海馬，該藥39mg/kg可增加其表達(dá)。 2.dl-PHPB對Aβ(25-35)致大鼠癡呆后學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其機(jī)制 側(cè)腦室注射Aβ(25-35)后第1天開始給藥，連續(xù)兩周，第9-13天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：dl-PHPB129mg/kg組的潛伏期明顯短于溶劑

9、對照組，39mg/kg組也有短于溶劑對照組的趨勢。平臺探索實(shí)驗(yàn)中，dl-PHPB129mg/kg組目標(biāo)象限活動時(shí)間百分比明顯長于溶劑對照組，39mg/kg組也有長于溶劑對照組的趨勢。另外，dl-PHPB有縮短動物第一次穿越平臺時(shí)間的趨勢。表明，大劑量dl-PHPB可明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 抗氧化檢測證明，dl-PHPB39和129mg/kg可降低癡呆大鼠皮層SOD活力(大劑量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)以及MDA含量，且有劑量依賴性。在

10、海馬，各組之間SOD活力和MDA含量無明顯差異。 與乙酰膽堿合成、代謝相關(guān)的酶活力測定發(fā)現(xiàn)，溶劑對照組皮層ChAT活力未見明顯改變，但與溶劑對照組比較，dl-PHPB39mg/kg可顯著增加ChAT活力，129mg/kg也有增加趨勢。海馬ChAT和AChE活力在各組之間無顯著差異。 采用Westernblotting方法檢測磷酸化tau蛋白。結(jié)果顯示：dl-PHPB可劑量依賴性地降低皮層396位點(diǎn)磷酸化tau蛋白的表達(dá)。

11、在海馬，模型組該蛋白表達(dá)增高趨勢明顯.但藥物對其無明顯影響。 3.dl-PHPB對快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其機(jī) 制跳臺實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五月齡SAMP8的被動回避反應(yīng)能力略有弱于SAMR1的趨勢。而十和十五月齡SAMP8的被動回避反應(yīng)能力均明顯弱于同齡SAMR1。但十五月齡的減弱程度比十月齡未進(jìn)一步增加。 水迷路實(shí)驗(yàn)觀察錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期兩項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示，五月齡SAMP8對臺階位置的記憶略弱于同齡SAMR1，十和

12、十五月齡SAMP8的記憶能力明顯弱于同齡SAMR1。隨著月齡增加，兩種小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力逐步下降，十月齡后維持在低水平，十五月齡不再進(jìn)一步降低。 以熒光強(qiáng)度降低值表示線粒體對Rhodamine123的攝取程度，間接反映線粒體膜電位。三個(gè)月齡實(shí)驗(yàn)中，SAMP8的熒光強(qiáng)度降低值均明顯低于SAMR1，其中十五月齡差異最大。從五到十月齡，兩種小鼠的熒光強(qiáng)度降低值明顯下降，十五月齡與十月齡相當(dāng)。同時(shí)，皮層線粒體ATP酶活力，SAMP8和S

13、AMR1從五到十月齡降低明顯，而十五同十月齡比較則變化較小。各月齡SAMP8均顯著低于同齡SAMR1。 生化研究顯示：五和十月齡時(shí)，兩種小鼠腦組織ChAT活力均維持在較高水平，而十五月齡時(shí)均顯著下降。十月齡時(shí)SAMP8海馬的ChAT活力低于同齡SAMR1。說明ChAT活力在不同月齡兩種動物腦組織間差異較小。皮層AChE活力在各月齡兩種小鼠間無顯著差異。但在海馬，五、十月齡SAMP8的AChE活力顯著高于同齡SAMR1，十五月齡時(shí)

14、，SAMP8卻顯著低于同齡SAMR1。 血清SOD隨著月齡增加，無論在SAMP8還是SAMR1均逐漸減少。但十月齡SAMP8的SOD活力略微高于SAMR1。十五月齡SAMP8的SOD活力則顯著低于SAMR1。血清MDA含量，隨著月齡增加，在兩種小鼠基本呈增加趨勢，但十和十五月齡之間無明顯差異。各月齡兩種小鼠之間也無顯著差異。 dl-PHPB對SAMP8小鼠作用的研究顯示：10月齡SAMP8小鼠，連續(xù)給藥35天。在跳臺實(shí)驗(yàn)

15、中，dl-PHPB50和160mg/kg可劑量依賴性地減少SAMP8的電擊次數(shù)，并延長電擊潛伏期。水迷路實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，dl-PHPB可減少SAMP8進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)，并縮短動物找到臺階的潛伏期。 同時(shí)，兩個(gè)給藥組海馬SOD活力均明顯下降。MDA含量降低趨勢明顯。在皮層，藥物沒有引起這兩項(xiàng)指標(biāo)的明顯變化。dl-PHPB還可增高SAMP8海馬ChAT活力，并有降低AChE活力的趨勢。在皮層，該藥沒有影響二者的活力。另外，dl-PHPB

16、160mg/kg組皮層線粒體ATP酶活力高于對照組。 與對照組比較，dl-PHPB對海馬396位點(diǎn)磷酸化tau蛋白的表達(dá)有顯著的降低作用，并有一定的劑量依賴性。而對皮層該蛋白的表達(dá)沒有明顯影響。 以上結(jié)果表明，dl-PHPB對慢性腦低灌注和Aβ誘導(dǎo)的癡呆以及快速老化小鼠的認(rèn)知缺陷均有確切的改善作用。除了改善大鼠腦組織的病理改變、減少活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞、增加微管相關(guān)蛋白2的分布和腦源性神經(jīng)生長因子的含量外，在本研究中所涉及