MiR-34b在兒童急性白血病中的表達(dá)、甲基化調(diào)控及臨床意義的研究.pdf

1、目的：研究miR-34b在兒童急性白血病中的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探討其臨床意義。同時(shí)檢測(cè)miR-34b對(duì)細(xì)胞增殖是否有影響，進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能。
　　方法：8種白血病細(xì)胞株（U937，HL-60，MV4-11，M2R，K562，Raji，CCRF， DAMI），兒童初診急性白血?。ˋL）患兒骨髓標(biāo)本87例，其中初診急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL）患兒55例，初診急性髓系白血?。ˋML)患兒32例，正常對(duì)照患兒43

2、例。提取細(xì)胞株或其骨髓標(biāo)本總RNA，并進(jìn)行引物特異性逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)miR-34b進(jìn)行檢測(cè)，循環(huán)閾值(Ct值)比較法進(jìn)行miRNA表達(dá)定量分析。統(tǒng)計(jì)分析白血病細(xì)胞株、初診AL、ALL、AML及MLL+各組患兒miR-34b表達(dá)是否有差異，并根據(jù)臨床資料進(jìn)行進(jìn)一步分析，以探討miR-34b在兒童初診AL、ALL及AML的意義。同時(shí)提取細(xì)胞株或其骨髓標(biāo)本DNA，進(jìn)行重亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

3、，運(yùn)用甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)miR-34b啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，并通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-aza-2-dC）處理HL-60及K562進(jìn)一步檢測(cè)其甲基化狀態(tài)，結(jié)合臨床資料進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析兒童初診AL、ALL及AML與其甲基化狀態(tài)是否相關(guān)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染hsa-miR-34b mimics到K562細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1、miR-34b在正常對(duì)照、白血

4、病細(xì)胞株、兒童初診AL、ALL、AML及MLL+各組的相對(duì)表達(dá)量(`x±s`x)分別為5.22±1.15、0.03±0.03、1.18±0.47、1.65±0.69、0.18±0.06、0.64±0.34，與正常對(duì)照組相比，兒童初診ALL組（P<0.05）、白血病細(xì)胞株組、初診AL組、AML組及MLL+組（P均<0.01）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、結(jié)合臨床資料（如性別、年齡、免疫分型、染色體、融合基因、潑尼松實(shí)驗(yàn)等）做了進(jìn)一步分析

5、，發(fā)現(xiàn)miR-34b的相對(duì)表達(dá)量與兒童初診ALL患兒潑尼松實(shí)驗(yàn)敏感與否相關(guān)（P<0.05）。
　　3、miR-34b啟動(dòng)子在8種白血病細(xì)胞株中均出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，甲基化陽(yáng)性率為100%，本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)50例兒童初診AL患兒，其中31例初診ALL患兒，19例初診AML患兒，其甲基化陽(yáng)性率分別為64%（32/50）、77.42%（24/31）和42.11%（8/19），同時(shí)檢測(cè)23例正常對(duì)照患兒，無(wú)一例出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。
　　4、5-

6、aza-2-dC處理白血病細(xì)胞株HL-60及K562后，miR-34b的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，分別為49.5倍和18.8倍，其甲基化條帶均明顯減弱。
　　5、結(jié)合臨床資料（如性別、年齡、免疫分型、染色體、融合基因、潑尼松實(shí)驗(yàn)等）做了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)miR-34b的甲基化狀態(tài)與兒童初診AL患兒的免疫分型相關(guān)，淋系與髓系的miR-34b的甲基化狀態(tài)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　6、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染hsa-miR-34b m

7、imics到K562細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為61%，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hsa-miR-34b mimics組48h、72h、96h及120h均出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制作用（P均<0.01），其中72h抑制作用最明顯，抑制率達(dá)45.7%。
　　結(jié)論：
　　1、miR-34b在白血病細(xì)胞株、兒童初診AL、ALL、AML及MLL+各組患兒中表達(dá)均明顯減低，提示miR-34b可能作為新的抑癌基因參與兒童初診A

8、L、ALL及AML的形成，同時(shí)在MLL基因重排陽(yáng)性兒童初診AL的發(fā)病中可能起著重要作用，并影響其預(yù)后。
　　2、miR-34b的相對(duì)表達(dá)量與兒童初診ALL患兒潑尼松實(shí)驗(yàn)敏感與否相關(guān)，提示其是否可以作為判定兒童初診ALL危險(xiǎn)度及預(yù)后的指標(biāo)。
　　3、miR-34b啟動(dòng)子在白血病細(xì)胞株、兒童初診AL、ALL及AML中均出現(xiàn)高度甲基化現(xiàn)象，提示miR-34b在白血病細(xì)胞株、兒童初診AL、ALL及AML中均受甲基化機(jī)制調(diào)控，可能作為

9、新的抑癌基因發(fā)揮作用。
　　4、5-aza-2-dC處理白血病細(xì)胞株HL-60及K562后，miR-34b的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，甲基化條帶明顯減弱，進(jìn)一步證實(shí)miR-34b在白血病細(xì)胞株中受甲基化機(jī)制調(diào)控。
　　5、miR-34b的甲基化狀態(tài)與兒童初診AL患兒的免疫分型相關(guān)，提示miR-34b啟動(dòng)子在兒童初診ALL患兒中甲基化頻率高于兒童初診AML患兒，miR-34b在兒童初診ALL及AML中可能作為新的抑癌基因發(fā)揮作用。<