2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、柑橘粉虱(Diaelorude citri Asahmaed)是廣泛存在于世界柑橘產(chǎn)區(qū)的重要害蟲。由于其具有刺吸式口器,可以吸食柑橘汁液,為害嚴(yán)重后引起落葉落果;更為可怕的是,柑橘粉虱可分泌黏性蜜露,蜜露將空氣中的灰塵吸附到葉片表面,并為一些霉菌提供營養(yǎng)物質(zhì),從而引發(fā)煤煙病,嚴(yán)重影響柑橘光合作用,造成減產(chǎn)。目前防治柑橘粉虱的主要方法是化學(xué)防治,但化學(xué)藥劑施用不當(dāng)往往導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、昆蟲抗藥性等一系列的問題。漸狹蠟蚧菌(子囊菌綱,肉座菌目,

2、蠟蚧菌屬)作為一種重要的昆蟲病原真菌,它可以穿透粉虱體壁,消耗其營養(yǎng),最終導(dǎo)致粉虱死亡,這為研制環(huán)保型微生物農(nóng)藥提供了可能。但是由于漸狹蠟蚧菌毒力弱,侵染周期長,還很難與化學(xué)農(nóng)藥競爭。本研究通過構(gòu)建基于粉虱免疫基因的RNAi載體,將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入蠟蚧菌,以期真菌侵染粉虱之際,釋放dsRNA,對粉虱免疫基因?qū)嵭懈蓴_,減弱昆蟲對病原真菌的免疫反應(yīng),從而實現(xiàn)毒力的增強。實施步驟如下:
  1.絲狀真菌RNAi載體的構(gòu)建
  以pBHt

3、2質(zhì)粒為模板,擴增PtrpC啟動子和PtrpC+ HygR元件;以pAN7-1為模版,擴增TtrpC終止子;利用StuⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶酶切掉pFGC5941的35S啟動子,置換上PtrpC啟動子,構(gòu)建成PtrpC+ Intron結(jié)構(gòu);利用MssⅠ和SmaⅠ內(nèi)切酶酶切掉pFGC5941的OCS終止子,置換上TtrpC終止子,構(gòu)建成PtrpC+Intron+TtrpC結(jié)構(gòu);利用EcoRⅠ和PstⅠ內(nèi)切酶酶切掉pFGC5941的MAS+Bl

4、pR元件,置換上PtrpC+ HygR元件。構(gòu)建成PtrpC+ hygR+ PtrpC+ Intron+TtrpC結(jié)構(gòu)。至此RNAi載體改造完成,并將改造后的載體命名為pRCy1。
  2.基于粉虱免疫基因RNAi載體的構(gòu)建
  查找柑橘粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,找到參與粉虱免疫相關(guān)的酚氧化酶原基因(PPO)、酚氧化酶原激活因子基因(PPO-AF)、溶菌酶基因(LZM)并設(shè)計引物,以cDNA為模板,克隆獲得PPO,PPO-AF,LZ

5、M以及PPO+PPO-AF融合基因的正反向結(jié)構(gòu),利用XhoⅠ和SwaⅠ酶切位點將以上4個基因的正向結(jié)構(gòu)連入pRCy1載體;利用XbaⅠ和BamHⅠ位點將4個基因的反向結(jié)構(gòu)連入pRCy1載體,構(gòu)建完成ihpRNA表達(dá)盒。
  3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ihpRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)化進(jìn)入漸狹蠟蚧菌
  將構(gòu)建完成的RNAi載體電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入EHA105農(nóng)桿菌菌株,通過誘導(dǎo)培養(yǎng)和共培養(yǎng),將質(zhì)粒ihpRNA表達(dá)盒整合進(jìn)入漸狹蠟蚧菌基因組中,在含有潮霉素

6、B的篩選培養(yǎng)基中獲得轉(zhuǎn)化成功的陽性菌株。
  4.轉(zhuǎn)基因漸狹蠟蚧菌的效果評價
  測定轉(zhuǎn)基因蠟蚧菌的單位產(chǎn)孢量和菌絲生長速率,發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比,轉(zhuǎn)基因菌株的生長速率沒有發(fā)生顯著性變化;而單位產(chǎn)孢量除La∷GFP菌株顯著增加外,其他菌株均沒有發(fā)生顯著變化。
  將轉(zhuǎn)基因菌株在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)10代,利用特異性引物檢測菌株的遺傳穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)第十代真菌均可擴增出陽性條帶。說明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化蠟蚧菌具有

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