蠟蚧輪枝菌入侵蚧蟲過程中胞外酶作用及提高酶活性的研究.pdf

1、蚧蟲屬昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea，全世界記錄25科，7355種，絕大多數(shù)是農(nóng)林、果樹和花卉的重要害蟲。蚧蟲最大的特點是體壁具有多種泌蠟腺體，分泌大量蠟質(zhì)，對蟲體起保護(hù)作用，化學(xué)防治困難。開展生物防治是控制蚧蟲的重要途徑，包括應(yīng)用天敵昆蟲和病原微生物。利用病原微生物防治害蟲具有可以人工擴(kuò)大培養(yǎng)菌種，制成生物制劑，進(jìn)行大面積應(yīng)用，不污染環(huán)境等優(yōu)點。蠟蚧輪枝菌Verticillium lecanii(

2、Zimm.)是一種蟲生真菌，最早由Nivter發(fā)現(xiàn)寄生咖啡蠟蚧(Lecanii coffeae)，然而目前主要用于防治粉虱和蚜蟲，防治蚧蟲的報道卻極少。本研究采用從蚧蟲和稻褐飛虱上分離出的蠟蚧輪枝菌兩菌株（No.V3.4504（來自蚧蟲）和No.V3.4505（來自稻褐飛虱））侵染蚧蟲，分析了入侵過程中蠟蚧輪枝菌蛋白質(zhì)酶和幾丁質(zhì)酶的作用機制;根據(jù)胞外酶的變化特點，比較了該菌對朝鮮毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龜蠟蚧侵染力的大小;研究了蚧蟲蜜

3、露的化學(xué)成分及其對蠟蚧輪枝菌入侵蚧蟲的影響，并探討了在培養(yǎng)基中加入蚧蟲表皮和氨基酸對蠟蚧輪枝菌蛋白酶活性的調(diào)節(jié)作用。為利用蠟蚧輪枝菌防治蚧蟲提供科學(xué)依據(jù)。
　　具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.蠟蚧輪枝菌對蚧蟲的感染和兩種胞外酶的作用采用從蚧蟲和稻褐飛虱上分離出的病原蠟蚧輪枝菌兩菌株為材料，用孢子懸浮液（濃度5×107孢子/mL）感染沙里院褐球蚧雌成蟲，對染菌后蟲體罹病癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，從染菌到蚧蟲死亡大約經(jīng)歷7天，染菌后第2天

4、在蟲體表面蠟粉稀薄的位置開始出現(xiàn)菌絲，5天后，蚧蟲表面菌絲大量生長，且交織在一起，蟲體表皮開始出現(xiàn)褶皺，收縮變小，7天后，菌絲層加厚，蟲體表皮萎縮，開始死亡。同時發(fā)現(xiàn)，蟲體腹面貼于樹皮，濕度比背面的大，孢子在體緣和腹面容易附著和萌發(fā)，在這兩個部位的菌絲比背面的多。通過顯微切片觀察，在該蚧蟲體壁的外表皮、內(nèi)表皮和真皮層都發(fā)現(xiàn)了入侵的菌絲，說明該菌已侵染成功。
　　以沙里院褐球蚧雌成蟲表皮制備成培養(yǎng)基，培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌兩菌株No.V3.

5、4504和No.V3.4505，分別測定在培養(yǎng)過程中第1-8d兩菌株的蛋白酶與幾丁質(zhì)酶活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在前6天連續(xù)上升，最大值為33.94±1.61U/g，然后降低;幾丁質(zhì)酶活性在前期維持在一個較低水平，第5天開始增加，最大值為7.28±1.36U/g。菌株No.V3.4505的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性變化趨勢與No.V3.4504相似。說明蛋白酶在菌絲侵染體壁的前期發(fā)揮作用，降解表皮中的蛋白質(zhì)，

6、使幾丁質(zhì)暴露，誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的大量產(chǎn)生，分解幾丁質(zhì)。
　　2.蠟蚧輪枝菌對三種蚧蟲侵染力大小的研究用朝鮮毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龜蠟蚧的表皮為培養(yǎng)基，培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌菌株No.V3.4504，測定了其蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以朝鮮毛球蚧表皮為培養(yǎng)基，菌的蛋白酶活在第1天為18.97±1.59U/g，沙里院褐球蚧表皮培養(yǎng)基的酶活為15.25±0.92U/g，它們的酶活都在第6天達(dá)到最大值，分別為34.58±1.01U/g和3

7、3.94±1.61U/g。但在日本龜蠟蚧表皮培養(yǎng)基上，其酶活的變化與前兩者不同，第1天僅為7.67±0.62U/g，然后持續(xù)增高至第7天，酶活性出現(xiàn)最大值34.30±0.48U/g，比前兩者推后了1天。朝鮮毛球蚧表皮培養(yǎng)基上菌的幾丁質(zhì)酶活性在第1天為7.23±0.67U/g，沙里院褐球蚧表皮培養(yǎng)基的幾丁質(zhì)酶活性僅為0.89±0.18U/g，而日本龜蠟蚧表皮培養(yǎng)基，幾丁質(zhì)酶活幾乎測不出來;在后續(xù)7天的培養(yǎng)中，以朝鮮毛球蚧表皮上培養(yǎng)的菌的幾

8、丁質(zhì)酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種。
　　對三種蚧蟲表皮的成分分析結(jié)果顯示，在每2.5g表皮中朝鮮毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龜蠟蚧的蛋白質(zhì)含量分別是2.0 g、2.1g和1.8g，幾丁質(zhì)的含量分別為0.2g、0.1g和0.1g。這說明蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性與蚧蟲表皮中蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的含量成正比。根據(jù)這兩種胞外酶的活性，認(rèn)為菌株No.V3.4504侵染三種蚧蟲的能力順序是朝鮮毛球蚧＞沙里院褐球蚧＞日本龜蠟蚧。
　　3.蚧蟲蜜露對蠟蚧輪枝

9、菌入侵的影響針對蚧蟲取食過程中從肛門排泄蜜露的習(xí)性，對蘋果樹上沙里院褐球蚧排泄蜜露的特點作了觀察，采用化學(xué)分析和氨基酸自動分析儀測定了該蚧蟲蜜露的化學(xué)成份，結(jié)果發(fā)現(xiàn):蜜露組分中可溶性糖占69％，水分占26％，并含有18種氨基酸。將蜜露稀釋為10％、20％、30％、40％、50％共5個濃度，培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌兩菌株，測定了它們的胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性。結(jié)果顯示，菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在蜜露濃度為10％時有最大值，為4.45±

10、0.18U/mL，然后隨著蜜露濃度增加，蛋白酶活性呈下降趨勢;而菌株No.V3.4505的蛋白酶活性在蜜露濃度為20％時出現(xiàn)最大值，為8.5±0.71U/mL，隨后，蛋白酶活性持續(xù)降低。
　　兩菌株No.V3.4504和No.V3.4505的幾丁質(zhì)酶的活性變化趨勢相同，都在蜜露濃度為10％時出現(xiàn)最大值，前者為0.144±0.012U/mL，后者為0.431±0.042U/mL，隨后其活性都隨蜜露濃度增加而降低。
　　上述結(jié)果

11、說明兩個問題，蜜露中高濃度糖對蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性有抑制作用，因此在蚧蟲分泌蜜露前期應(yīng)用蠟蚧輪枝菌會有好的效果;兩個菌株比較，菌株No.V3.4505更能適應(yīng)在蜜露上生存。
　　4.蠟蚧輪枝菌蛋白酶活性調(diào)節(jié)試驗比較了基本培養(yǎng)基和加入蚧蟲表皮的培養(yǎng)基對蠟蚧輪枝菌的蛋白酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入蚧蟲表皮能提高蛋白酶的活性，菌株No.V3.4504增長幅度在2倍-12倍之間，菌株No.V3.4505增長幅度在2倍-3倍之間。

12、>　　同時試驗了培養(yǎng)基中分別加入氨基酸Ala、Met、Gly、 Pro對蠟蚧輪枝菌兩菌株的蛋白酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):加入Met對蛋白酶的活性有提高作用，其中菌株No.V3.4504的增長了256.9％，菌株No.V3.4505增長了215.7％。
　　通過在液體培養(yǎng)基中加入不同量Met，培養(yǎng)菌株No.V3.4504，發(fā)現(xiàn)Met在0.25％和0.5％兩個濃度下對該菌的蛋白酶的活性有極顯著促進(jìn)作用。說明Met作為調(diào)節(jié)劑，有一定的濃度