應(yīng)用HMGB1特異性拮抗物延長同種移植物存活時(shí)間的研究.pdf

1、急性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致臨床同種移植術(shù)失敗的主要原因。一般認(rèn)為，T細(xì)胞應(yīng)答及其效應(yīng)是介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)發(fā)生的主要機(jī)制。 已證實(shí)：T細(xì)胞激活有賴于雙信號(hào)，即TCR特異性識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(APC)所提呈抗原肽而產(chǎn)生的第一信號(hào)，以及APC與T細(xì)胞表面共刺激分子相互作用所提供的第二信號(hào)。 同種器官移植中，由于外科手術(shù)、缺血/缺氧和缺血再灌注等因素，使受者體內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)激和炎性“瀑布式”反應(yīng)，可產(chǎn)生多種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，從而激活A(yù)PC并誘導(dǎo)

2、同種反應(yīng)性T細(xì)胞活化。因此，阻斷內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)乃抑制移植排斥反應(yīng)的重要策略。 高遷移率族蛋白B1(HMGB1，highmobilitygroupbox1)是一種核內(nèi)蛋白，在30余年前已被發(fā)現(xiàn)。其組成性表達(dá)于各種組織細(xì)胞的胞核內(nèi)，具有多種重要的核內(nèi)功能。近年發(fā)現(xiàn)，HMGB1也可出現(xiàn)于胞外，其來源為：由壞死細(xì)胞(而非凋亡細(xì)胞)被動(dòng)釋放，或由受刺激的單核/巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌。釋放至胞外的HMGB1可與多種免疫細(xì)胞相互作用，直接介導(dǎo)非特異

3、性炎癥反應(yīng)，也可作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)激活A(yù)PC[主要是樹突狀細(xì)胞(DC)]，從而啟動(dòng)、增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答，并參與多種疾病過程發(fā)生和發(fā)展。 實(shí)驗(yàn)研究中，阻斷胞外HMGB1的活性，已成為干預(yù)相關(guān)疾病過程的重要策略。HMGB1的截短形式A盒蛋白和抗HMGB1中和抗體均為HMGB1拮抗物，可特異性逆轉(zhuǎn)HMGB1的胞外活性。使用該兩種拮抗物，可緩解實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎及膿毒血癥病情，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率。 本課題通過建立小鼠同種腹部異位心臟移

4、植模型，觀察急性移植排斥反應(yīng)中移植物HMGB1表達(dá)，探討HMGB1與急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性；在此基礎(chǔ)上，制備并應(yīng)用HMGB1的特異性拮抗物GST-Abox重組蛋白，觀察對(duì)移植物存活時(shí)間的影響，并初步探討其機(jī)制。 一、HMGB1表達(dá)與同種急性排斥反應(yīng)相關(guān)性 實(shí)驗(yàn)分組為：①異基因心臟移植組，供者為BALB/C近交系小鼠，受者為C57BL/6近交系小鼠；②同基因心臟移植組，供者為和受者均為C57BL/6近交系小鼠。 前期

5、實(shí)驗(yàn)證明：異基因心臟移植組移植物平均存活時(shí)間為7.67±1.03天，同基因心臟移植組未出現(xiàn)排斥反應(yīng)。在移植后1d、3d、7d觀察如下指標(biāo)：移植心臟中炎性細(xì)胞浸潤、移植心臟HMGB1mRNA表達(dá)水平、移植心臟炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如下： 1.術(shù)后1d，同種移植心臟HMGB1和TNF-α的mRNA表達(dá)即升高，但與同系對(duì)照表達(dá)相當(dāng)，兩組中IFN-γ表達(dá)均未上調(diào)； 2.術(shù)后3d，HMGB1和TNF-α表達(dá)持續(xù)上升，術(shù)

6、后7天表達(dá)量達(dá)高峰，與同系對(duì)照相比，差異有顯著性(P＜0.05)； 3.術(shù)后7d，同種移植心臟IFN-γ的mRNA表達(dá)上調(diào)，與同系對(duì)照相比，差異有顯著性(P＜0.05)； 以上結(jié)果表明：HMGB1可能是一種排斥反應(yīng)相關(guān)因子，其不僅與TNF-α共同參與移植術(shù)后早期發(fā)生的非特異性炎癥應(yīng)答，且可能與其后的急性排斥反應(yīng)(即同種抗原特異性應(yīng)答)有關(guān)。 二、HMGB1特異性拮抗物GST-Abox的制備、純化和功能鑒定

7、 成功構(gòu)建PGEX-4T-2-Abox原核表達(dá)載體，并通過原核表達(dá)獲得大量GST-Abox重組蛋白；借助親和純化及去內(nèi)毒素處理，重組蛋白純度和特異性大大增強(qiáng)；生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GST-Abox可有效拮抗HMGB1的生物學(xué)功能。 三、應(yīng)用HMGB1特異性拮抗物可延長移植心臟存活時(shí)間 借助腹腔注射，術(shù)前1d至術(shù)后4d每天向受者體內(nèi)輸入100μl(1mg)GST-Abox重組蛋白，以干預(yù)同種排斥反應(yīng)，并設(shè)立GST對(duì)照組和空白對(duì)照

8、組，于術(shù)后7d及/或移植心臟停跳時(shí)檢測如下指標(biāo)： 1.GST-A盒重組蛋白對(duì)異基因移植心臟存活時(shí)間的影響 應(yīng)用GST-A盒重組蛋白能明顯延長移植心臟存活時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組平均存活時(shí)間為12.5±1.87天，與陰性對(duì)照組(6.5±1.04天)和空白對(duì)照組(7.67±1.03天)相比有顯著性差異(p＜0.05)。 2.移植心臟HE染色 與對(duì)照組相比，GST-Abox處理組心肌細(xì)胞間淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少，未出現(xiàn)毛細(xì)血

9、管淤血、間質(zhì)出血、動(dòng)脈炎和靜脈炎等現(xiàn)象。 3.GST-A盒重組蛋白對(duì)受者小鼠脾臟DC共刺激分子表達(dá)的影響 借助流式細(xì)胞術(shù)分別檢測移植后6天各組受者小鼠脾臟DC共刺激分子CD80、CD86表達(dá)，結(jié)果表明： *與GST組對(duì)照組(MFI=149.97)和NS對(duì)照組(MFI=122.92)相比，GST-Abox處理組脾臟DC表達(dá)CDS0明顯下調(diào)(MFI=44.94)，差異有顯著性(p＜0.05)； *與GST組對(duì)

10、照組(MFI=305.62)和NS對(duì)照組(MFI=274.15)相比，GST-Abox處理組脾臟DC表達(dá)CD86下調(diào)(MFI=242.83)，但差異無顯著性(p＞0.05)。 4.GST-A盒重組蛋白對(duì)受者小鼠脾臟IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)量的影響 借助細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測移植后7天各組受者小鼠脾臟IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果如下： *GST-Abox處理組、GST對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組Th1細(xì)胞(CD4+IFN

11、-γ+)分別為11.35％、17.35％和12.41％，差異不明顯； *GST-Abox處理組Tc1細(xì)胞(CD8+IFN-γ+)為22.96％，明顯少于GST組對(duì)照組(33.23％)和生理鹽水對(duì)照組(35.57％)。 5.移植心臟HMGB1和細(xì)胞因子mRNA表達(dá) 術(shù)后1d、3d、7d分別采取各組移植心臟組織，提取總RNA，借助實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測HMGB1、TNF-α、和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果

12、如下： *GST組和NS組各時(shí)段HMGB1、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平相近，差異無顯著性； *與上述兩組相比，術(shù)后3d和7dGST-Abox處理組HMGB1及TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有顯著性(p＜0.05)； *與上述兩組相比，術(shù)后7dGST-Abox處理組IFN-γ的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有顯著性(p＜0.05)。 以上結(jié)果表明：GST-Abox重組蛋白具有抗排斥

13、效應(yīng)，其抗排斥反應(yīng)的機(jī)制與下調(diào)受者脾臟DC共刺激分子表達(dá)、阻抑Tc1細(xì)胞極化及下調(diào)移植物HMGB1和炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。 四、GST-Abox延長移植物存活的機(jī)制 1.GST-Abox重組蛋白對(duì)LPS刺激所致DC成熟的影響 用GST-Abox重組蛋白與LPS、未成熟DC共孵育24h后檢測DC表型，結(jié)果表明：應(yīng)用GST-Abox重組蛋白后，表達(dá)MHCⅡ類分子、CD80和CD86陽性的DC細(xì)胞數(shù)分別為27.16％

14、、41.19％和47.05％，與LPS刺激組相比有顯著性差異(p＜0.01)，表明GST-Abox重組蛋白可拮抗LPS誘導(dǎo)的DC成熟。 2.LPS可刺激DC主動(dòng)分泌HMGB1 *用1μg/mlLPS刺激未成熟DC(C57BL/6小鼠骨髓來源)24hr，借助免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測HMGB1在DC細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明：LPS刺激后，HMGB1在DC細(xì)胞中定位發(fā)生變化，由胞核向胞漿遷移； *在刺

15、激前(Ohr)、刺激后8、16、24hr分別取細(xì)胞上清和刺激前后的細(xì)胞沉淀，進(jìn)行Western-blot檢測，結(jié)果表明：刺激前后DC細(xì)胞總HMGB1水平無差別，刺激后8hr細(xì)胞上清中即可檢出HMGB1，且呈時(shí)間依賴性逐漸增加，至24hr達(dá)到高峰。以上結(jié)果表明：LPS可刺激DC主動(dòng)分泌HMGB1。 3.GST-Abox重組蛋白可抑制單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 用未成熟DC與LPS、GST-Abox重組蛋白預(yù)孵育8hr后，與同種T

16、細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，3H-TdR摻入法檢測T細(xì)胞增殖，結(jié)果表明：LPS刺激后的DC細(xì)胞可明顯促進(jìn)異基因T淋巴細(xì)胞增殖；GST對(duì)該效應(yīng)無影響；而GST-Abox重組蛋白則可拈抗此效應(yīng)。 以上結(jié)果提示：非成熟DC轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C過程中，能自分泌HMGB1，后者對(duì)DC進(jìn)一步成熟具有重要意義；GST-Abox延長移植心臟存活的機(jī)制之一可能與阻抑DC表型和功能成熟有關(guān)。 結(jié)論 1.HMGB1與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生相關(guān)，其