TLR5靶向同種移植物放射性實(shí)時(shí)監(jiān)測及自噬在同種排斥中的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　本論文分為三部分對TLR5與Autophagy在同種移植耐受的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯像和分子調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的深入研究。1、選擇免疫抑制劑雷帕霉素誘導(dǎo)的小鼠同種移植模型，以TLR5為靶點(diǎn)，制備放射性核素131-I標(biāo)記的抗TLR5單克隆抗體為分子顯像劑，通過體內(nèi)注射，對移植排斥模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)對比監(jiān)測，為無創(chuàng)性移植耐受后的移植物實(shí)時(shí)監(jiān)測探索新的途徑;2、在同種移植模型中，通過與非特異性顯像劑18F-FDG和同種型IgG進(jìn)行對比，評價(jià)T

2、LR5作為特異性耐受顯像劑在雷帕霉素使用后對移植物的顯像價(jià)值;3、對比研究自噬在同種移植模型移植排斥過程中變化及意義，初步探討其影響同種移植排斥的可能的分子機(jī)制。
　　第一部分靶向TLR5的放射性核素標(biāo)記抗體對雷帕霉素治療的同種移植物動(dòng)態(tài)監(jiān)測
　　方法：
　　1、小鼠同種移植模型的建立
　　以C57BL/6小鼠為供體，將其背部全厚度皮膚移植到受體BALB/c小鼠，建立同種移植排斥模型;分為對照組和雷帕霉素處理組，

3、處理組在移植術(shù)后每日腹腔注射雷帕霉素1.5mg/Kg直至對照組移植皮膚完全被排斥，對照組術(shù)后每日腹腔注射等量的PBS(phosphate buffered saline)。
　　2、131I標(biāo)記的放射性示蹤劑的制備和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　Iogogen法制備并純化131I-anti TLR5 mAb。分別將131I-anti TLR5 mAb置于小鼠血清和生理鹽水中，37℃水浴，0h，12h，24 h，48 h，72 h和96

4、h分別檢測標(biāo)記物體外穩(wěn)定性。通過BALB/c小鼠脾細(xì)胞的單位點(diǎn)放射性配體與受體結(jié)合分析檢測131I-anti TLR5 mAb的Kd Bmax和KI值。
　　3、131I-anti TLR5 mAb在同種移植模型中的體內(nèi)生物學(xué)分布研究在移植術(shù)后第7天向2組實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈分別注射131I-anti TLR5 mAb（0.37MBq/只），在注射后1h，12h，24 h，48 h和72 h，分別各取5只小鼠，脫頸椎處死，收集血液、移植

5、皮膚、對側(cè)正常皮膚以及各個(gè)器官組織，稱重，測量放射性，研究131I-anti TLR5 mAb在模型小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布狀況，并計(jì)算靶（移植皮膚）與非靶（對側(cè)正常皮膚）放射性分布的比值。
　　結(jié)果：
　　1、131I-anti-TLR5 mAb標(biāo)記率為96.9％，比活度為458.6 MBq/mg，并且有良好的免疫學(xué)活性，Kd值為3.672 nM，最大結(jié)合量Bmax為5.388μM，半抑制濃度(IC50)和抑制常數(shù)(Ki)分別

6、為8.89 nM和40.38 nM。131I-anti-TLR5 mAb體外放置72 h，放射化學(xué)純度大于90％。
　　2、體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果顯示，雷帕霉素治療組，注射131I-anti-TLR5 mAb1 h移植皮膚的％ID/g值達(dá)到最大值，為12.05±1.86，注射后72 h，T/NT值達(dá)到最大，為8.10±0.10;而131I-anti-TLR5 mAb雖然也在排斥對照組移植部位聚集，但是明顯低于耐受組(p＜0.001)。

7、TLR5阻斷組全身組織器官放射性比活度明顯降低，移植皮片部位％ID/g降低92％，表明移植部位的131I-anti-TLR5 mAb攝取是特異性的。
　　3、動(dòng)態(tài)全身放射性自顯影圖像的結(jié)果與體內(nèi)生物學(xué)分布相一致，顯示在注射12h后，131I-anti-TLR5 mAb在雷帕霉素耐受組移植物部位明顯濃聚且明顯高于對照組，在72 h獲得移植皮膚對比度最為清晰顯像。移植部位放射性活度分別為26，448±904 DLU/mm2(雷帕霉素治

8、療組)，9176±576 DLU/mm2（移植排斥組）和3881.5±62.6 DLU/mm2（阻斷組）(p＜0.05)。TLR5阻斷組移植皮膚放射性濃聚圖像幾乎不可見。
　　4、131I-anti-TLR5 mAb在兩組實(shí)驗(yàn)小鼠移植物皮膚部位的攝取與同一組織TLR5的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r2=0.93，P＜0.0001)。
　　第二部分131I-anti TLR5 mAb/131I-IgG/18F-FDG在雷帕霉素治療的同種

9、移植模型中顯像價(jià)值的評價(jià)
　　方法：
　　1、建立小鼠同種移植模型
　　以C57BL/6小鼠為供體，將其背部全厚度皮膚移植到受體BALB/c小鼠，建立同種移植排斥模型。將模型小鼠分為對照組和雷帕霉素治療組;治療組在移植術(shù)后每日腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/Kg，直至對照組小鼠移植皮膚完全排斥，對照組術(shù)后每日腹腔注射等量的PBS。
　　2、131I標(biāo)記的放射性示蹤劑的制備和生物學(xué)活性檢測
　　131I-ant

10、i TLR5 mAb制備及鑒定方法同第一部分;Iogogen法制備并純化對照同種型示蹤劑131I-IgG。分別將131I-IgG放入小鼠血清和生理鹽水中，37℃水浴，0h，12h，24 h，48 h，72 h和96 h分別檢測標(biāo)記物體外穩(wěn)定性。3、131I-anti TLR5 mAb、131I-IgG和18F-FDG在同種移植模型動(dòng)態(tài)分子顯像中的對比研究
　　結(jié)果：
　　1、131I-IgG標(biāo)記率為96.2％，比活度為407

11、.2 MBq/mg，在小鼠血清和生理鹽水中測定的體外穩(wěn)定性在72 h后均高于90％。
　　2、在注射131I-IgG12 h后顯示其在雷帕霉素治療組移植皮膚部位出現(xiàn)濃聚，但是其放射性活度明顯低于131I-anti TLR5 mAb，表明131I-anti TLR5 mAb在移植皮膚部位濃聚是標(biāo)記物與TLR5受體特異性結(jié)合的結(jié)果，而非同種型IgG Fc段的非特異性結(jié)合所致。
　　3、18F-FDG的高攝取圖像僅出現(xiàn)在對照組，而

12、雷帕霉素治療組移植物對18F-FDG的攝取量很低，圖像上幾乎不可見。131I-anti-TLR5 mAb則在雷帕霉素治療組持續(xù)高攝取。131I-anti-TLR5 mAb與18F-FDG最高T/NT比值分別為（7.68和1.16）(p＜0.001)。這表明131I-anti-TLR5 mAb對雷帕霉素應(yīng)用后的移植物分子影像檢測與非特異性顯像劑相比有明顯的優(yōu)勢。
　　第三部分同種移植排斥過程中自噬分子的表達(dá)及意義
　　方法：<

13、br>　　1、建立小鼠同種移植模型和雷帕霉素治療組模型方法見第一部分。
　　2、自噬水平以及自噬發(fā)生相關(guān)基因和蛋白在移植模型盡力過程中的表達(dá)變化在小鼠同種移植模型術(shù)后的第4天，第8天，第12天和第16天，脫椎處死小鼠，分別取移植皮膚和脾，提取總mRNA和總蛋白。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測移植皮膚和脾細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin1，ATG5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Western bl

14、ot技術(shù)檢測移植皮膚和脾細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Belcin1，ATG5和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ表達(dá)檢測自噬發(fā)生水平。
　　3、同種移植小鼠移植皮膚部位131I-anti-TLR5 mAb攝取與自噬發(fā)生水平的相關(guān)性分析
　　以同種移植排斥組和雷帕霉素治療組小鼠移植皮膚部位免疫組織化學(xué)TLR5染色測得的TLR5表達(dá)量與相應(yīng)自噬的水平做相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示在同種排斥組中，自噬相關(guān)基因

15、Becln1和ATG5均從移植術(shù)后第8天起升高，在第12天達(dá)到高峰，在第16天下降。在雷帕霉素治療組出現(xiàn)同樣的趨勢，從第8天起的表達(dá)明顯高于同種移植組。而且兩組移植皮膚部位的表達(dá)均明顯高于脾細(xì)胞(p＜0.01)。
　　2、Western blot結(jié)果顯示Beclin1和ATG5蛋白表達(dá)與其基因表達(dá)水平一致:Becln1和ATG5均從移植術(shù)后第8天起升高，第12天達(dá)到高峰，第16天下降。在同種移植組，自噬相關(guān)分子LC3-Ⅱ/LC3-

16、Ⅰ比值（自噬發(fā)生水平）在雷帕霉素治療組最高，而且在同種移植急性排斥反應(yīng)較強(qiáng)時(shí)明顯升高，在同種移植急性排斥反應(yīng)減弱后隨之降低(p＜0.01)，表明自噬與移植排斥反應(yīng)呈明顯相關(guān)。更重要的是我們發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因與蛋白的變化在移植皮膚部位的變化比在脾臟的變化更加顯著。
　　3、自噬分子與TLR5表達(dá)相關(guān)性分析:同種移植排斥模型中，移植皮膚部位自噬發(fā)生水平與TLR5的表達(dá)成正相關(guān)(r2=0.79)。
　　結(jié)論：
　　1.制備了1

17、31I-anti-TLR5 mAb，經(jīng)鑒定具有良好的特異性和生物學(xué)活性
　　2.體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果顯示，在同種移植模型中，131I-anti-TLR5 mAb被移植皮膚部位高攝取，顯著高于對側(cè)正常皮膚;與同種移植模型相比，雷帕霉素治療后移植皮膚部位對131I-anti-TLR5 mAb的攝取的T/NT值更高。全身磷屏放射自顯影結(jié)果與體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果一致，在雷帕霉素應(yīng)用后，131I-anti-TLR5 mAb對移植物清晰顯像。