細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9對同種移植排斥的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、迄今為止，器官移植仍是挽救終末期臟器衰竭的最有效措施。器官移植包括同種移植、異種移植和自體移植（同系移植）三大類，其中同種異基因移植是臨床最常見的移植類型。移植排斥反應(yīng)是由多種基因相互作用引起的復(fù)雜病理生理過程，是造成移植物損傷并最終導(dǎo)致治療失敗的最重要因素。近年來免疫抑制療法的成功實(shí)施已使移植物短期存活方面得到明顯改善，然而移植物長期存活和患者生存率方面并未獲得明顯進(jìn)步。目前臨床上常用的免疫抑制劑既無法消除復(fù)雜基因調(diào)控引起的持續(xù)免疫損

2、傷，同時還顯著抑制患者免疫功能，降低移植受者的生存質(zhì)量，這是目前器官移植領(lǐng)域面臨的嚴(yán)重問題。因此，研究尋找可在炎癥起始階段有效干預(yù)控制、靶向多種移植排斥相關(guān)基因的靶分子，設(shè)計出更高效高選擇性的抑制移植排斥反應(yīng)的制劑，對于進(jìn)一步闡明移植排斥機(jī)制和改善臨床器官移植成功率具有重要理論和實(shí)際意義。
　　細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9(Cyclin-dependent kinase9，CDK9)是正性轉(zhuǎn)錄延長因子b(Positive transc

3、ription elongation factorb，P-TEFb)的催化激酶，通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ)的羧基末端和負(fù)性轉(zhuǎn)錄延長因子，使轉(zhuǎn)錄從起始部位開始延伸。CDK9磷酸化RNAPⅡ是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄延伸過程中的關(guān)鍵限速環(huán)節(jié)。初始反應(yīng)基因(Primary Response Genes，PRGs)是一組誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號，且其表達(dá)無需啟動蛋白質(zhì)合成的基因。在信號反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄鏈中，這些“第一反應(yīng)”的信

4、號發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括神經(jīng)細(xì)胞的生存可塑性，心肌應(yīng)激反應(yīng)，葡萄糖代謝等多種復(fù)雜的的生物學(xué)過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CDK9可通過控制初始反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，在炎癥發(fā)生發(fā)展中起中心調(diào)控作用。CDK9包括兩個亞型，CDK942和CDK955，兩個亞型在不同器官組織和細(xì)胞中的表達(dá)各有不同。例如有研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞CDK955分子亞型的表達(dá)量逐漸減少，CDK942分子亞型的表達(dá)量逐漸相應(yīng)增多。
　　鑒于CDK9對炎

5、癥的中心調(diào)控作用，本論文對CDK9是否增強(qiáng)同種移植排斥反應(yīng)及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的深入研究，目的是闡明CDK9抑制劑對同種移植物生存狀態(tài)的影響，并研究其作用機(jī)制、調(diào)控因素及其調(diào)控的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，明確CDK9的兩個分子亞型在同種排斥反應(yīng)中的差異表達(dá)，從而為研究靶向CDK9特異亞型誘導(dǎo)同種移植物耐受提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床器官移植排斥提供新的治療手段。
　　第一部分同種移植受體CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1表達(dá)與移植物

6、生存相關(guān)性研究
　　研究方法
　　1.同種排斥過程中移植物CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1的動態(tài)表達(dá)
　　1.1構(gòu)建小鼠同系和同種移植模型
　　無菌條件下，分別將BALB/c和C57BL/6小鼠全厚度皮片移植到BALB/c小鼠背部并進(jìn)行包扎，此兩種模型分別作為同系移植組和同種移植組。同種移植組進(jìn)一步分為PHA747691（CDK9抑制劑）給藥組和生理鹽水對照組:在移植術(shù)進(jìn)行第-1、1、3、5、7、9、11日

7、向?qū)嶒?yàn)組小鼠灌胃給藥PHA767491(3，10，30mg/kg);等體積生理鹽水為對照組。于移植術(shù)后第4、8、12和16天脫椎處死小鼠，每組至少3只，分離移植皮片和脾臟。
　　1.2移植物CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1的表達(dá)
　　取移植術(shù)后第4、8、12和16天的同系移植組和同種移植對照組的皮膚移植物，提取總RNA，利用RT-qPCR方法，檢測CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1在同種排斥過程中的表達(dá)及變化。

8、r>　　2.CDK9抑制劑對同種移植排斥受體脾CD4+T細(xì)胞差異表達(dá)基因的影響
　　在排斥高峰期處死同種移植對照組小鼠，用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒分離純化脾CD4+T細(xì)胞，用3μM PHA767491或等量PBS處理細(xì)胞2h。從本實(shí)驗(yàn)室前期建立的相同模型移植排斥相關(guān)基因SAGE文庫中選出一定數(shù)量的差異表達(dá)基因，用RT-qPCR方法檢測CDK9抑制后這些差異表達(dá)基因在受體小鼠排斥高峰期脾CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.CDK

9、9抑制劑對同種移植物生存期的影響
　　小鼠同種皮片移植術(shù)后第7天，拆除包被物，逐日觀察記錄兩組模型小鼠移植物的生存狀況，以移植皮片90％壞死作為完全排斥。移植術(shù)后第12天處死小鼠，HE染色觀察移植物的病理變化，免疫組化染色檢測移植物CDK9的表達(dá)。
　　4.CDK9抑制劑對同種移植受體脾CD4+T細(xì)胞比例的影響
　　移植后第12天處死小鼠，流式細(xì)胞術(shù)分析CDK9抑制劑對同種移植受體排斥高峰期脾CD4+T細(xì)胞的影響。

10、r>　　5.CDK9抑制劑對同種移植受體皮膚移植物CD4+T細(xì)胞的影響
　　取移植術(shù)后第12天的同種移植受體小鼠的移植皮片，常規(guī)操作進(jìn)行免疫組化染色，檢測抑制CDK9對排斥期受體皮膚移植物CD4+T細(xì)胞浸潤的影響。
　　研究結(jié)果
　　1.CDK9表達(dá)與同種排斥具有顯著正相關(guān)性:CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1在同種移植對照組中的表達(dá)顯著高于同系移植組。CDK9的表達(dá)水平在同種排斥高峰期達(dá)到最高，并隨著排斥反應(yīng)的緩

11、解而降低;在同種排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中Cyclin T1與CDK9的表達(dá)趨勢一致。結(jié)果表明CDK9表達(dá)與同種排斥反應(yīng)具有顯著正相關(guān)性。
　　2.CDK9調(diào)控CD4+T細(xì)胞同種排斥相關(guān)基因:CD4+T細(xì)胞是同種移植排斥反應(yīng)發(fā)生與否的決定因素，本論文從本實(shí)驗(yàn)室前期建立的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的同種移植排斥基因SAGE文庫中選取相關(guān)差異表達(dá)基因，并檢測CDK9抑制對這些移植排斥相關(guān)基因的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，PHA767491處理組的STAT1

12、、JAk2、Socs5、RhoA、Ly6e、Med8和Med11的mRNA水平較對照組顯著降低，而Gna13和Fbxw4的mRNA水平較對照組明顯升高，表明CDK9上調(diào)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的同種排斥反應(yīng)相關(guān)基因，下調(diào)移植耐受基因。
　　3.CDK9抑制明顯延長同種移植物存活期:同系移植組未發(fā)生排斥;同種移植對照組的皮膚移植物較早出發(fā)生排斥。與同種對照組相比，PHA767491給藥組移植物排斥發(fā)生延后且進(jìn)程較緩慢。對照組小鼠移植皮片在

13、過繼后第10-11天發(fā)生排斥，而PHA767491給藥組在第17-18天排斥(p＜0.05)。結(jié)果表明CDK9抑制劑顯著改善移植物生存狀態(tài)，延長其存活期。
　　4.移植物病理及免疫組化染色結(jié)果: HE染色切片顯示，對照組的移植皮片炎性反應(yīng)明顯，有大量單核巨噬細(xì)胞浸潤;而在PHA767491給藥組，移植皮片組織的炎性反應(yīng)較輕，單核巨噬細(xì)胞浸潤明顯減弱。免疫組化染色結(jié)果顯示，在PHA767491處理組，皮膚移植物處CDK9表達(dá)水平顯著

14、降低。結(jié)果提示CDK9表達(dá)水平與排斥嚴(yán)重程度正相關(guān)，CDK9抑制可明顯延長同種皮膚移植物生存期。
　　5.CDK9抑制可顯著降低同種移植受體CD4+T細(xì)胞比例:流式分析結(jié)果表明，同種移植組受體脾CD4+T細(xì)胞顯著高于同系移植組，而PHA767491可顯著抑制同種排斥反應(yīng)引起的CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增。免疫組化染色結(jié)果表明，PHA767491體內(nèi)應(yīng)用可顯著抑制同種皮膚移植物CD4+T細(xì)胞浸潤。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CDK9高表達(dá)促進(jìn)同種移植排斥反

15、應(yīng)。
　　第二部分 CDK9抑制劑對CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的同種移植排斥的影響及機(jī)制研究
　　研究方法
　　1.構(gòu)建CD4+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸C57BL/6-SCID小鼠同種皮膚移植模型
　　無菌狀態(tài)下，將野生型C57BL/6小鼠全厚度皮片移植到SCID小鼠右側(cè)背部，并用創(chuàng)口貼和透明膠帶進(jìn)行包扎固定，術(shù)后第7天拆包。移植術(shù)3周后，移植皮片愈合。分離純化野生型BALB/c小鼠脾CD4+T細(xì)胞，分別用PHA767491(3μ

16、M)和等體積PBS處理細(xì)胞6小時，然后分別通過腹腔注射過繼轉(zhuǎn)輸?shù)缴鲜鯟57BL/6-SCID同種移植受體小鼠體內(nèi)作為PHA767491處理組和對照組。
　　2.CDK9抑制劑對CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的同種皮片移植物生存的影響
　　過繼CD4+T細(xì)胞后，逐日觀察并記錄兩組小鼠移植皮片生存情況。過繼后第12天對移植皮片HE染色，顯微鏡下觀察其病理變化。
　　3.CDK9抑制劑對過繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的同種排斥反應(yīng)的影響

17、r>　　3.1 CDK9抑制劑對過繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子譜的影響
　　CD4+T細(xì)胞過繼第12天，脫椎處死兩組小鼠，獲得小鼠移植皮片、移植同側(cè)腋窩引流淋巴結(jié)和脾。利用細(xì)胞因子蛋白芯片分別檢測皮膚移植物、腋窩引流淋巴結(jié)和脾CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和IL-22的水平。
　　3.2 CDK9抑制劑對過繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細(xì)胞中同種Teff活化的影響
　　CD4+T細(xì)胞過繼后第7天，提取脾

18、同種反應(yīng)性CD4+CD25-Teff，并提取野生型BALB/c小鼠Teff作為陰性對照，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD69、CD25和胞內(nèi)IL-2水平。
　　3.3 CDK9抑制劑體外處理對Teff增殖能力的影響
　　提取野生型BALB/c小鼠CD4+CD25-Teff，用PHA767491(3μM)和等量的PBS處理Teff2小時，之后加入抗CD3抗體(2μg/ml)和抗CD28抗體(1μg/ml)刺激細(xì)胞，利用CCK8法檢測

19、Teff增殖情況。
　　4.CDK9抑制劑對CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞的影響
　　4.1 CDK9抑制劑對同種移植受體Treg細(xì)胞亞群比例的影響
　　細(xì)胞過繼后第12天處死兩組小鼠，應(yīng)用CD4、CD25、Foxp3流式抗體對小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。
　　4.2 CDK9抑制劑體外處理對Treg細(xì)胞增殖能力的影響

20、
　　分離野生型BALB/c小鼠脾臟CD4+CD25+ Treg細(xì)胞。用PHA767491(3μM)或等量的PBS處理分離的Treg細(xì)胞2小時，之后加入抗CD3抗體(2μg/ml)和抗CD28抗體(1μg/ml)刺激細(xì)胞，利用CCK8法檢測Treg細(xì)胞增殖狀況。
　　4.3 CDK9抑制劑體外處理對Treg細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控功能的影響
　　分離純化野生型BALB/c小鼠脾臟CD4+CD25+ Treg和CD4+CD25-T

21、eff細(xì)胞。用PHA767491(3μM或5μM)或等量的PBS處理分離的Treg細(xì)胞2小時，之后與Teff細(xì)胞混合，并加入抗CD3抗體(2μg/ml)和抗CD28抗體(1μg/ml)刺激細(xì)胞，利用CCK8法檢測Treg對Teff的抑制。
　　研究結(jié)果
　　1.成功建立同種移植模型:移植術(shù)后3周，移植部位愈合，移植皮片生長良好，表明C57BL/6-SCID小鼠同種皮膚移植模型成功建立。對照組的移植物在細(xì)胞過繼后第12-15天

22、發(fā)生排斥，而PHA767491處理組在第23-27天排斥，表明CDK9抑制劑處理可明顯減弱CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的同種排斥反應(yīng)，延長同種移植物生存期。
　　2.CDK9促進(jìn)Th1極化:在同種皮膚移植物和脾臟CD4+T細(xì)胞中，PHA767491處理組IFN-γ水平較對照組顯著降低，而IL-4和IL-10的水平顯著升高。腋窩引流淋巴結(jié)未檢測到細(xì)胞因子水平改變。IL-17和IL-22均無顯著變化。結(jié)果提示CDK9通過促進(jìn)Th1極化增強(qiáng)同種移

23、植排斥。
　　3.CDK9促進(jìn)同種反應(yīng)性Teff的活化和增殖:為探討CDK9是否在細(xì)胞活化階段促進(jìn)同種排斥反應(yīng)，本論文在細(xì)胞過繼后第7天（過繼轉(zhuǎn)輸?shù)腡細(xì)胞開始識別同種抗原）提取受體小鼠脾Teff，利用流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8法檢測細(xì)胞活化和增殖情況。結(jié)果顯示，PHA767491處理組Teff的CD69、CD25和胞內(nèi)IL-2水平及增殖能力均明顯低于對照組。結(jié)果表明CDK9在同種反應(yīng)性Teff活化和增殖過程中起促進(jìn)作用。
　　4

24、.CDK9提高同種移植受體Treg細(xì)胞比例:PHA767491處理組小鼠Treg細(xì)胞亞群在脾CD4+T細(xì)胞中的比例顯著高于對照組。而兩組Treg的增殖能力無顯著區(qū)別，PHA767491處理對Treg的抑制能力也無顯著影響。結(jié)果提示PHA767491可通過抑制Teff的活化和增殖，相應(yīng)提高同種移植受體Treg細(xì)胞比例。
　　第三部分 CDK942和CDK955亞型在同種移植排斥中作用機(jī)制的研究
　　研究方法
　　1.CD

25、K9兩個亞型在同種抗原刺激下的表達(dá)
　　用野生型C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞制備的可溶性同種抗原對PHA767491(3μM)或PBS預(yù)處理2h的BALB/c小鼠CD4+T細(xì)胞進(jìn)行梯度時間刺激，留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，備用。用Western blot檢測各時間點(diǎn)CDK942、CDK955、 RNA聚合酶Ⅱ和β-actin的表達(dá)。
　　2.CDK9兩亞型在同種抗原刺激下的轉(zhuǎn)位
　　分離上述細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白，用West

26、ern blot和ELISA檢測各時間點(diǎn)細(xì)胞核、胞漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的CDK942、 CDK955以及其伴侶蛋白Cyclin T1的表達(dá)。
　　3.CDK942的核質(zhì)轉(zhuǎn)位促進(jìn)形成炎癥微環(huán)境
　　為探究CDK942的轉(zhuǎn)位對細(xì)胞外微環(huán)境所起作用，本文用ELISA檢測上述方法2中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、 IL-1β和IL-6的水平。
　　4.CDK942活化STAT1/IFN-γ信號通路
　　4.1 CDK9活化

27、的移植排斥相關(guān)基因與STAT1相關(guān)
　　用CDK9 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞系，從CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的移植排斥基因SAGE文庫中選出多個基因，用實(shí)時定量PCR檢測CDK9 siRNA轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞系中相關(guān)基因水平，探討CDK9對移植排斥反應(yīng)相關(guān)信號通路的作用。
　　4.2 PHA767491顯著抑制STAT1的活化
　　用可溶性同系抗原或同種抗原對IL-6單克隆抗體、IFN-γ單克隆抗體、PHA7

28、67491(3μM)或等量PBS預(yù)處理2h的野生型BALB/c小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行刺激，用磷酸化STAT1和磷酸化STAT3的流式抗體染色，用流式細(xì)胞術(shù)分析STAT1和STAT3的活化。
　　5.CDK9主要通過調(diào)控STAT1促進(jìn)同種排斥反應(yīng)
　　建立小鼠同種皮膚移植模型，移植術(shù)后12天處死小鼠并取移植皮片進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片、免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察皮膚移植物CDK9、STAT1、STAT3和STAT5的表達(dá)。

29、　　研究結(jié)果
　　1.CDK942是同種排斥的主要分子亞型:同種抗原刺激后15min開始，CDK942亞型的表達(dá)水平逐漸升高，而CDK955明顯降低，RNA聚合酶Ⅱ與CDK942亞型的表達(dá)趨勢基本一致。PHA767491處理顯著抑制這三者的表達(dá)，提示CDK942是應(yīng)答同種抗原刺激、促進(jìn)下游免疫反應(yīng)的主要分子亞型。
　　2.CDK942轉(zhuǎn)位促進(jìn)形成炎癥微環(huán)境:隨著同種抗原刺激，CDK942從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，并釋放到胞外，而C

30、DK955較穩(wěn)定地在核內(nèi)表達(dá)。Cyclin T1相應(yīng)轉(zhuǎn)位，但其表達(dá)趨勢與CDK9兩個亞型均不一致。對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、 IL-1β和IL-6水平顯著升高，表達(dá)趨勢與CDK942一致。PHA767491可顯著抑制CDK942的轉(zhuǎn)位以及上清液中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，提示CDK942的轉(zhuǎn)位可促進(jìn)形成炎癥微環(huán)境。
　　3.CDK9抑制劑明顯降低STAT1相關(guān)基因表達(dá):CDK9抑制組的CXCL9、CXCL10、CXCL11、GB

31、P4、STAT1、JAk2和Socs5的mRNA表達(dá)水平較對照組顯著降低，這些基因均與STAT1相關(guān)，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞活化、細(xì)胞生長與維持和信號傳導(dǎo);與上述基因相比，與STAT3相關(guān)的基因如C4a、CXCL12、Chl1和Socs3無顯著改變。
　　4.CDK9主要通過調(diào)控STAT1/IFN-γ信號通路影響同種排斥反應(yīng):同種抗原刺激下，STAT1的活化水平明顯高于STAT3，IFN-γ阻斷組STAT1和STAT3的活化均被顯著抑

32、制，但I(xiàn)L-6阻斷組僅STAT3的活化受抑制，而且PHA767491顯著抑制磷酸化STAT1和STAT3的表達(dá)。結(jié)果表明，與STAT3相比，STAT1在同種反應(yīng)中發(fā)揮更重要的促炎作用;CDK9在此過程中可能主要通過活化STAT1/IFN-γ信號通路而促進(jìn)同種排斥反應(yīng)。
　　5.免疫組化染色結(jié)果:與對照組相比，PHA767491給藥組移植物CDK9和STAT1受到顯著抑制，STAT3的表達(dá)也相應(yīng)降低。STAT5在同種排斥組和PHA7

33、67491處理組均低水平表達(dá)，兩組間無顯著差異，提示CDK9主要通過調(diào)控STAT1促進(jìn)同種排斥反應(yīng)。
　　全文結(jié)論
　　1.同種移植物CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1表達(dá)水平與移植物的損害程度密切正相關(guān)。CDK9抑制劑體內(nèi)應(yīng)用可顯著延長同種移植物生存期。
　　2.CDK9抑制劑體內(nèi)應(yīng)用可明顯提高同種移植受體CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例，顯著抑制Teff活化和增殖，而對Treg的增殖和免疫負(fù)調(diào)控功

34、能無明顯影響。
　　3.CDK942是應(yīng)答同種抗原刺激、促進(jìn)下游免疫應(yīng)答的主要分子亞型，調(diào)控多種移植排斥相關(guān)基因，其轉(zhuǎn)位可促進(jìn)形成炎癥微環(huán)境。CDK9主要通過活化STAT1/IFN-γ信號通路促進(jìn)同種排斥反應(yīng)。
　　全文創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.首次研究CDK9在同種移植排斥反應(yīng)中的作用，證實(shí)CDK9抑制劑PHA767491可明顯延長小鼠皮膚同種移植物生存期，誘導(dǎo)移植免疫耐受形成。研究結(jié)果為臨床器官移植排斥提供新的治療手段。