病毒載體介導(dǎo)B7-H1延長(zhǎng)同種異體小鼠皮膚移植物存活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、誘導(dǎo)宿主對(duì)供體特異性的免疫耐受，可以從根本上解決臨床器官移植中的免疫排斥問題。雖然應(yīng)用免疫抑制劑可以有效地抑制宿主免疫系統(tǒng)對(duì)移植物的排斥反應(yīng)，但長(zhǎng)期大劑量地使用免疫抑制劑具有明顯副作用，因?yàn)樗谝种泼庖吲懦夥磻?yīng)的同時(shí)，極大地削弱了患者的免疫防御功能，增加了患者發(fā)生腫瘤和機(jī)會(huì)性嚴(yán)重感染的概率。盡管人們從多方面改進(jìn)了誘導(dǎo)免疫耐受的策略，并在一些動(dòng)物試驗(yàn)中取得了成功，但真正具有臨床應(yīng)用價(jià)值的可行方案并不多。通過共刺激分子抑制T細(xì)胞的活化和增殖

2、來誘導(dǎo)免疫耐受是近年來移植免疫的研究熱點(diǎn)。 B7-H1能夠提供T細(xì)胞活化的負(fù)性共刺激信號(hào)，廣泛表達(dá)于淋巴組織和非淋巴組織，是影響效應(yīng)性和記憶性T細(xì)胞功能的重要共刺激分子。其受體PD-1(programmeddeath 1)與CTLA-4結(jié)構(gòu)相似，是CD28家族的第4個(gè)成員，胞外區(qū)氨基酸序列上與CTLA-4分子的有24％同源性，主要以單體形式表達(dá)于活化的CD4<'+>T和CD8<'+>T細(xì)胞及B細(xì)胞表面。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：B7-H

3、1結(jié)合PD-1后，能抑制已經(jīng)活化的T細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子，特別是能夠顯著抑制效應(yīng)性CD8<'+>T細(xì)胞的活化。在T細(xì)胞受到抗原刺激時(shí)，B7-H1/PD-1信號(hào)通路能拮抗正性的B7-CD28共刺激信號(hào)，提示B7-H1/PD-1信號(hào)通路對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。B7-H1在非淋巴組織的表達(dá)，提示它們可以下調(diào)自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞在外周組織中的應(yīng)答，可能參與自身耐受的形成。研究證實(shí)，增強(qiáng)B7-H1的表達(dá)可以下調(diào)已活化的T、B細(xì)胞在外周組織

4、中的應(yīng)答，在維持外周T、B細(xì)胞耐受中發(fā)揮重要的作用。 本研究構(gòu)建了表達(dá)小鼠B7-H1基因的慢病毒載體，試圖通過B7-H1基因的表達(dá)在不同的小鼠品系間誘導(dǎo)同種異體皮膚移植耐受。為了探討B(tài)7-H1在誘導(dǎo)皮膚移植耐受中的作用及其生物學(xué)功能，我們完成了如下四部分工作： 1．構(gòu)建表達(dá)小鼠B7-H1基因的慢病毒穿梭載體plenti6/V5-D-TOPO/mB7-H1重組子：用RT-PCR方法從C57BL/6小鼠肝臟組織中克隆獲得B7

5、-H1 cDNA全長(zhǎng)ORF，并定向克隆到plenti6/V5-D-TOPO載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無突變。 2．表達(dá)小鼠B7-H1基因的慢病毒的包裝：在293FT包裝細(xì)胞完成了表達(dá)B7-H1基因的慢病毒包裝。測(cè)定B7-H1重組慢病毒和空病毒的滴度分別為3.4×10<'8>TU/ml和8.5×10<'8>TU/ml。病毒感染B16F10細(xì)胞后，免疫組織化學(xué)法證實(shí)B16F10細(xì)胞表面有B7-H1和V5蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒感染B1

6、6F10細(xì)胞后B7-H1融合蛋白的陽(yáng)性率為36％。 3．B7-H1重組腺病毒的制備和鑒定。B7-H1重組腺病毒為段文元博士制備成功，鑒定正確的重組腺病毒大量擴(kuò)增，通過GFP熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定B7-H1重組腺病毒和對(duì)照空病毒的滴度分別為1×10<'12>TU/ml和3×10<'12>TU/ml。 4．B7-H1在延長(zhǎng)同種異體皮膚移植存活時(shí)間中的作用：以C57BL/6小鼠為供皮鼠，BALB/c小鼠為受皮鼠行同種異體皮膚移植。將7

7、0只BALB/c小鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組(A組)、環(huán)孢霉素A(CsA)處理組(B組)、B7-H1重組慢病毒處理組(C組，LV/B7-H1)、慢病毒空病毒載體處理組(D組，LN/B7-HO)、B7-H1重組腺病毒處理組(E組，AD/B7-H1)，腺病毒空病毒載體處理組(F組，AD/B7-HO)，B7-H1重組慢病毒和B7-H1重組腺病毒共處理組(G組，LV/B7-HO+AD/B7-H1)，每組10只。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，從A組到

8、G組移植皮片平均存活時(shí)間(Mean survival time，MST)分別為：10.80±1.87；14.80±3.43；20.5±4.30；11.1±2.42；15.6±2.32；10.7±2.06和16.1±2.73天。A、D、F皮膚移植物的MST無顯著性差異(P>0.05)，說明單純使用慢病毒、腺病毒載體對(duì)移植皮片的存活無明顯影響；而B、C、E、G組MST與A組比較均明顯延長(zhǎng)，有顯著性差異(P<0.01)，說明病毒載體介導(dǎo)B7H