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文檔簡介
1、[研究背景] 終末期肝病為我國的常見病、多發(fā)病。肝臟移植是最佳治療方法乃至唯一選擇。隨著手術技術不斷完善,以及免疫抑制劑的應用,肝臟移植得到廣泛開展,但肝臟移植后影響器官存活的最大障礙是受體對移植器官的排斥反應。 選擇在肝移植排斥反應發(fā)展過程中起重要作用的基因作為靶點,是肝臟移植排斥反應轉基因治療的關鍵之一。隨著對肝臟移植排斥反應發(fā)生、發(fā)展分子生物學機制的研究深入,已發(fā)現(xiàn)在肝臟移植排斥反應的發(fā)病過程中涉及到多個共刺激分子
2、通路的過度表達。T細胞活化需要雙信號[8,9,10];第一信號是TCR識別APCs上的抗原肽-MHC復合體,這一信號決定了T細胞活化特異性;第二信號是T細胞上的CD28與APCs上B7分子的結合形成的所謂CD28-B7共刺激通路,它對維持和進一步活化T細胞至關重要;之后,活化的T細胞表達CTIA4分子,CTLA4和CD28都是T細胞上與B7結合的同源受體,CTLA4與B7結合負調節(jié)T細胞的活化[11,12,13]。 [目的]:構
3、建能在真核細胞表達的含大鼠B7-1反義基因片段的載體,為進一步研究B7-1反義基因抑制肝臟移植的排斥作用奠定基礎。 [方法]: 1.設計含有Xho I和BamH I酶切位點的一對引物,通過PCR技術擴增獲取質粒載體pcDNA3-B7-1上的目的片段B7-1(426bp),經過純化的B7-1 cDNA和PMD18-T載體經過連接,轉化,鑒定而得到中間載體質粒PMD18-T-B7-1。 2.經Xho I和BamH I
4、雙酶切PMDl8-T-B7-1及pcDNA3B(-)真核表達載體后,使用T4DNA連接酶連接,構建反義B7-1表達載體。 pcDNA3B(-)真核表達載體的Xho I和BamH I酶切位點與B7-1全基因序列所含酶切位點相反。 3.構建好的重組質粒采用PCR、酶切及測序鑒定。 [結論]: 成功構建了大鼠B7-1反義真核表達載體,為研究器官移植時阻斷B7-1/CD28共刺激通路抑制排斥反應的發(fā)生奠定了基礎。
5、 [研究背景] 肝臟移植是治療終末期肝病的最佳方法乃至唯一的選擇。決定肝臟移植成敗的關鍵問題之一是受體對移植器官的排斥反應,受體對移植器官的排異反應根源于T淋巴細胞的激活和增生。 所有的B7樣分子和它們的受體都是I型跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族。 B7家族各成員之間有20%-35%氨基酸序列是相同的。B7-1(CD80)和B7-2(CD86)是研究的最廣泛的T細胞協(xié)同刺激分子,二者分別結合的受體包括C
6、D28、CTLA-4、ICOS、PD-1(程序性死亡分子)和BTLA(B、T細胞弱化因子)。所有這些協(xié)同信號分子不僅提供促進T細胞生長、分化和產生細胞因子的正向信號(CD28和ICOS),同時還能通過提供負向信號來限制、終止和/或減弱T細胞應答(CTLA-4、PD-1和BTLA)。改變這些協(xié)同分子的表達可以調控免疫反應的強度和方向。 本實驗利用反義B7-1于體外冷保存期間轉染供肝,對介導大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應起關
7、鍵作用的第二信號進行阻斷,應用Wester blot和熒光免疫組織化學技術分別檢測B7-1蛋白的表達情況,觀察反義B7-1對供體肝細胞共刺激分子B7-1表達的抑制作用。 [目的]:建立大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應模型,觀察應用反義B7-1在大鼠肝移植術后對共刺激分子B7-1和CD4/CD8T細胞的影響及其抗排斥反應的作用,探討反義B7-1療法在對抗急性排斥反應中的作用。 [方法]: 1.雄性近交系DA大
8、鼠120只,購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心,體重160-200g;雄性近交系Lewis大鼠120只,購自北京維通利華實驗動物有限公司.體重180-200g;pcDNA3B-B7-1反義真核表達質粒為自己構建。 2.采用"二袖套管"法,建立DA→Lewis大鼠配對組合的ROLT急性排斥反應模型,動物術前12h禁食不禁水。凡ROLT術后存活48h以上者納入本研究,并按隨機表法分為2組。A組:對照組(n=60):DA→Lewis RO
9、LT模型,供肝冷保存期間門靜脈注射生理鹽水1ml,冷保存一個小時,共分為移植術后1,2,3,4,5d組及生存情況觀察組6組,每組10只大鼠;B組: pcDNA3B-B7-1/Lipofectamine2000組(n=60):DA→Lewis ROLT模型,供肝冷保存期間門靜脈注射pcDNA3B-B7-1 100μg,只大鼠,同樣分為6組。然后2組動物分別于移植術后1,2,3,4,5d處死收集肝臟標本。 3.一般情況觀察觀
10、察2組受體鼠術后的精神狀態(tài)、運動、食欲、耳廓和皮膚黃染程度,以及小便顏色。 4.Western blot半定量:提取組織標本總蛋白,以β-肌動蛋白(β-actin)為內參,檢測B7-1蛋白的表達。 5.肝移植急性排斥反應的組織病理學診斷,按Banff系統(tǒng)將急性排斥的程度進行評分,確定排斥活動性指數(shù)(Rejectiona ctivity index,RAI)。 6.免疫組化:應用免疫組織化學SABC法(免疫熒光),
11、檢測肝臟組織中B7-1蛋白表達情況,檢測CD4、CD8 T細胞的浸潤情況,分析CD4、CD8 T細胞的浸潤與肝移植急性排斥反應的關系。 7.觀察試驗組和對照組大鼠的長期生存情況,并進行Log-rank生存分析。 [結論]: 1.B7-1/CD28共刺激通路成為抑制肝移植急性排斥反應的新靶點。 2.肝竇內皮細胞作為抗原遞呈細胞其共刺激分子B7-1的表達明顯上調;具有誘導CD4、CD8 T細胞向大鼠肝臟浸潤的
12、作用。 3.應用反義B7-1可以降低移植肝組織中B711的表達,降低了肝竇內皮細胞對CD4、CD8 T細胞的誘導作用,有效抑制急性排異反應。 4.反義基因技術局部應用能夠影響靶基因的表達,抑制其功能。反義基因技術將成為肝臟移植控制排斥反應研究的新方向。 [研究背景] 肝內膽管結石在東南亞尤其是中國為常見病和多發(fā)病,是良性肝門膽管狹窄的主要病因[1,2]。肝內膽管結石的手術要點是去除肝內外膽管中的結石、狹窄
13、及感染灶,必要時可行肝葉部分切除術,形成通暢的管道。通常采用Roux-en-Y型膽管空腸吻合(Roux-en-Y hepaticojejunostomy,RYHJ)進行外科治療[3,4]。然而采用RYHJ的遠期療效并不令人滿意。這類手術廢棄了肝外膽道及Oddi括約肌的生理功能,帶來的膽汁流向的改變和消化道的改建,并且腸內容物和活化胰液的反流,使得反流性膽管炎及膽管結石復發(fā)不可避免。[5,6,7,8,9,10]在一宗314例肝內膽管結石治
14、療的回顧性研究中表明,RYHJ的遠期結石的發(fā)生率和膽管炎的復發(fā)率為22.0%[11]。Bismuth H的研究表明,RYHJ的復發(fā)性膽管炎的發(fā)生率為10-15%[12]。十二指腸乳頭括約肌能夠維持正常的膽道內壓,因而能夠預防細菌的反流。細菌感染是膽管內棕色結石形成的重要原因,一方面許多細菌可以分泌外源性β-葡萄糖醛酸酐酶(β-G)[13,14],該酶可以裂解結合膽紅素為非結合膽紅素,與鈣結合形成膽紅素鈣沉淀。另一方面在膽道產生大量粘泥,
15、主要成分是多糖蛋白質復合物,它們在膽管結石形成和發(fā)展以及膽管的阻塞中都起到了非常重要的作用[15]。由于RYHJ的明顯缺陷,Li等[11]提出應該慎重考慮RYHJ的適應癥,該術式適用于合并先天性膽管擴張或并發(fā)乳頭括約肌功能失調的病人。為了保存膽道的生理功能,自1997年我們采用帶血管蒂的膽囊瓣來修復肝門膽管狹窄與缺損(hepatic portal choledochoplasty with a pedicled graft of gal
16、lbladder,HPC)并同時應用常規(guī)RYHJ方法。我們回顧性分析了1997年以來接受這兩種術式的病人資料,探討HPC對良性肝門膽管狹窄的治療效果。 [目的]:肝內膽管結石合并肝門膽管狹窄通常采用RYHJ進行外科治療,使得反流性膽管炎及膽管結石復發(fā)不可避免。我們采用改良的帶血管蒂膽囊瓣肝門膽管成形術(HPC)治療良性肝門膽管狹窄并探討其治療效果。 [方法]: 1.病例選擇:1997年1月-2006年1月,10年
17、間在我院因肝內膽管結石伴肝門膽管炎性狹窄行HPC或RYHJ獲得隨訪的患者共149例,且滿足以下條件:(1)所有研究對象均經B超、CT及/或ERCP確診為肝內膽管結石并肝門膽管狹窄。(2)術中膽道鏡檢查及術后B超檢查或拔除T管前行膽道造影證實無膽道殘石。根據(jù)手術方式不同分HPC組和RYHJ組。 2.對兩組病人資料進行均衡性檢驗,觀察他們的圍手術期安全性和術后膽管炎的發(fā)生、結石復發(fā)的情況。 [結論]: 1.HPC手術
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