宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對PEDV復(fù)制的影響.pdf

1、一般來說病毒感染后，宿主對病毒侵染最初的應(yīng)答是天然免疫應(yīng)答，如細胞凋亡、炎性反應(yīng)和抗病毒免疫分子分泌等，通過這些免疫機制，宿主可以拮抗病毒的入侵，或者為宿主建立獲得性免疫應(yīng)答贏得時間從而最終清除入侵的病毒。但是，很多病毒在長期進化的過程中獲得了避免細胞過早凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的能力，從而得以在宿主體內(nèi)大量增殖，最終導致疾病的發(fā)生。
　　冠狀病毒(Coronavirus，CoVs)這一大類病毒廣泛存在于自然界中，常見禽類、哺乳動物以及

2、人類都易感。自2003年SARS-CoV(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)的流行到2012年的MERS-CoV（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV）的出現(xiàn)，引起了全世界人類的恐慌，2010-2013年豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)在世界大范圍肆虐

3、更是重創(chuàng)了世界畜牧業(yè)，至此，人們才對冠狀病毒感染后致病的嚴重程度以及快速的傳播能力給予了足夠的重視。PED是由套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科（Coronavirinae）α-冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）的豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，該病是豬的一種急性、高度接觸傳染性的腸道疾病，以嚴重的腸

4、炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征，各種日齡的豬均易感，尤其是哺育仔豬，發(fā)病率有時高達100％，死亡率為30～80％。因此，開展PEDV復(fù)制機制相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有重要性，在解析冠狀病毒的復(fù)制機制方面更有普遍的借鑒意義。
　　本研究在對PEDVN蛋白核定位特性研究的基礎(chǔ)上，進一步利用免疫共沉淀和GST-pull down試驗發(fā)現(xiàn)并證實PEDVN蛋白和NPM1蛋白存在相互作用，并通過激光共聚焦試驗發(fā)現(xiàn)，N蛋白和NPM1蛋白共定位于細胞

5、的核仁中。隨后通過GST-pull down方法對兩者相互作用結(jié)構(gòu)域進一步鑒定，發(fā)現(xiàn)N蛋白aa147-294與NPM1蛋白的aa189-294是兩者相互作用的必需區(qū)域，并且NPM1蛋白的K263R突變可以促進N和NPM1的相互作用。在探索NPM1蛋白在N蛋白核仁定位的作用中發(fā)現(xiàn)N蛋白的核仁定位并不依賴NPM1蛋白的核質(zhì)穿梭功能。在研究NPM1蛋白對病毒復(fù)制的作用中發(fā)現(xiàn)，在PEDV感染的細胞中NPM1蛋白的表達顯著上調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)過表達NP

6、M1蛋白時，可促進N蛋白的表達和PEDV的增殖;相反，利用靶向NPM1蛋白的特異性干擾小RNA分子沉默PEDV易感細胞內(nèi)源性NPM1蛋白的表達，N蛋白的表達和PEDV的增殖均受到抑制。進一步對其分子機制研究發(fā)現(xiàn)N蛋白和NPM1蛋白相互作用使其兔子被切割，上調(diào)細胞的抗凋亡能力，避免細胞過早凋亡，進而促進病毒的復(fù)制。
　　病毒從感染宿主細胞開始，宿主和病毒無時無刻不在相互作用。為了篩選與PEDV相互作用的宿主蛋白，本研究應(yīng)用酵母雙雜交

7、系統(tǒng)和GST-pull down技術(shù)分別發(fā)現(xiàn)PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之間存在相互作用。隨后我們進一步用免疫共沉淀，激光共聚焦試驗證明了PEDVM蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之間確實存在相互作用。有趣的是，在研究NSP7和HSP47蛋白共定位時發(fā)現(xiàn)，單獨表達NSP7和HSP47蛋白時，發(fā)現(xiàn)NSP7蛋白定位在宿主細胞的細胞核中，HSP47蛋白分布在宿主細胞的

8、細胞質(zhì)中，然而當NSP7和HSP47蛋白共同表達時，兩者共定位在宿主細胞的細胞核周邊，說明兩者的相互作用改變了這兩種蛋白的亞細胞分布。本研究中另一項重要的內(nèi)容是PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用是否影響PEDV的復(fù)制，以及影響PEDV復(fù)制的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)PEDVM蛋白和宿主蛋白EB3以及菲結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用對PEDV復(fù)制的影響正好是對立的，在PEDV感染的細胞

9、中，EB3蛋白表達顯著增加，并且我們通過轉(zhuǎn)染表達有EB3蛋白真核表達重組質(zhì)粒來上調(diào)Vero E6中內(nèi)源性的EB3蛋白，通過檢測M蛋白的表達情況和TCID50測定，結(jié)果顯示可以促進M蛋白的表達并且顯著增強PEDV的增殖。而病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用對病毒復(fù)制的影響正好相反，研究發(fā)現(xiàn)在PEDV感染48h和60h，HSP47蛋白表達顯著降低，進一步通過轉(zhuǎn)染表達有HSP47蛋白真核表達重組質(zhì)粒來上調(diào)Vero E6中內(nèi)源性