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文檔簡介
1、丙型肝炎病毒(HCV,hepatitis C virus)感染可影響宿主細(xì)胞信號的傳導(dǎo)、改變細(xì)胞基因的表達(dá),宿主基因表達(dá)的變化可能影響病毒的感染或參與病毒的致病。本課題通過表達(dá)譜基因芯片分析,找出了一個在HCV感染后表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞分子:硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP,thioredoxin-interactingprotein),并發(fā)現(xiàn)敲低Huh7細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)會抑制J6/JFH1株HCVcc的感染。進(jìn)一步對TXNIP進(jìn)行深入研
2、究,驗(yàn)證其差異表達(dá),探討其對HCV感染的影響:1、HCV通過什么機(jī)制誘導(dǎo)TXNIP上調(diào);2、TXNP在HCV的生命周期中發(fā)揮什么作用;3、HCV感染誘導(dǎo)的TXNIP上調(diào)是否參與到HCV的致病過程。希望通過研究,揭示宿主分子TXNIP與HCV相互作用的分子機(jī)制,探討TXNIP分子對HCV感染與致病的影響。
本文主要結(jié)果及結(jié)論如下:
?。ㄒ唬〩CV感染誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞系表達(dá)譜變化,宿主分子TXNIP轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)
3、利用MOI=1的HCVcc感染Huh7細(xì)胞,感染72 h以后用抽提感染細(xì)胞以及對照組細(xì)胞的總RNA,樣品送生物技術(shù)技術(shù)公司進(jìn)行Glue Grant Human TranscriptomeArray基因芯片分析,比較HCVcc感染前后的Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異。發(fā)現(xiàn)了871個顯著上調(diào)基因(上調(diào)≥1.5倍),765個下調(diào)基因(下調(diào)≤0.66倍);2339個上調(diào)顯著的非編碼RNA,2479個下調(diào)顯著的非編碼RNA;27條變化顯著的miRNA,以
4、及210個可變剪切方式變化顯著的基因??梢钥闯?,在Huh7細(xì)胞系感染HCVcc以后,宿主分子TXNIP的mRNA上調(diào)約3.7倍。采用RT-PCR法,對感染HCVcc和對照組的Huh7細(xì)胞中TXNIP的mRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行驗(yàn)證,再一次確定了在HCVcc感染的Huh7細(xì)胞中TXNIP轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。為進(jìn)一步研究HCVcc感染后基因表達(dá)譜變化,對用MOI=1的HCVcc感染12h,36 h,60 h的Huh7細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度
5、測序,并將其與各時間點(diǎn)的對照樣品進(jìn)行對比,結(jié)果表明:TXNIP的mRNA在HCVcc感染后36h,60 h均有明顯上調(diào),以36h上調(diào)最為顯著。
?。ǘ└蓴_TXNIP表達(dá)會使HCV復(fù)制受到影響
合成針對TXNIP的siRNA,轉(zhuǎn)染Huh7或Huh7.5.1細(xì)胞以敲低TXNIP的表達(dá)。感染MOI=0.2的HCVcc,48 h后免疫熒光檢測HCVcc的感染。結(jié)果顯示,TXNIP敲低的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染非特異結(jié)合的siRNA陰性對照
6、組以及未轉(zhuǎn)染siRNA的空白對照組相比,HCVcc的感染量顯著降低。將構(gòu)建好的TXNIP真核表答載體轉(zhuǎn)染到Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞中,陰性對照為轉(zhuǎn)染GFP真核表答載體的細(xì)胞,空白對照的細(xì)胞不進(jìn)行任何處理。隨后感染MOI=0.2的HCVcc,48 h后免疫熒光檢測HCVcc的感染。結(jié)果顯示,TXNIP過表答的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)質(zhì)粒的陰性對照以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照細(xì)胞相比,HCVcc的感染有所提高。
為檢測宿主分子TXN
7、IP對HCV入侵的影響,將siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7.5.1細(xì)胞系中降低TXNIP表達(dá),陰性對照為轉(zhuǎn)染非特異結(jié)合的siRNA,空白對照不做處理,分別感染HCV入侵模型:con1型的HCVpp。培養(yǎng)72 h后直接在熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光標(biāo)記的HCVpp感染細(xì)胞,并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,敲低TXNIP的表達(dá)不影響HCVpp的入侵。
為檢測宿主分子TXNIP對HCV復(fù)制的影響。在1b基因型HCV亞基因組復(fù)制子BB7細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染siRN
8、A干擾TXNIP的表達(dá),對照組轉(zhuǎn)染非特異結(jié)合的siRNA。轉(zhuǎn)染72 h后抽提BB7細(xì)胞系中RNA,采用RT-PCR檢測J6/JFH1型HCV非結(jié)構(gòu)基因的含量。結(jié)果顯示降低宿主分子TXNIP的表達(dá),HCV的復(fù)制水平隨之明顯降低。
綜上所述,宿主細(xì)胞中的TXNIP對HCV的感染有促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用可能作用于HCV復(fù)制階段。
(三)HCV感染不會誘導(dǎo)Huh7.5.1細(xì)胞系中TXNIP上調(diào)
為驗(yàn)證HCVcc感染
9、誘導(dǎo)TXNIP上調(diào)的情況是否在其它可以感染HCV的細(xì)胞系中成立,在Huh7和Huh7.5.1中進(jìn)行了更細(xì)致的研究。其中Huh7.5.1和Huh7相比,RIG-1基因發(fā)生突變,因此在病毒RNA誘導(dǎo)的IFN合成方面具有缺陷。用MOI=0.5的HCVcc感染Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞,分別取感染12h、以及1-4天的樣本以及相應(yīng)的對照樣本,用RT-PCR檢測TXNIP mRNA的變化情況。結(jié)果顯示,在Huh7細(xì)胞中,HCVcc感染1天以后
10、即可以檢測到TXNIP在mRNA水平和蛋白水平上的上調(diào)。而在Huh7.5.1細(xì)胞中,HCVcc感染并沒有使TXNIP的mRNA和蛋白表達(dá)量有所提高。
?。ㄋ模└蓴_素誘導(dǎo)Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞系中TXNIP上調(diào)
分別合成IFN-α、IFN-β以及IFN-λ的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收取細(xì)胞上清以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清(對照)。用不同濃度的干擾素上清處理HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞,2天后免疫熒光
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