人HCV亞復(fù)制子的斑馬魚肝臟復(fù)制模型的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)是一種具包膜的單股正鏈RNA病毒。持續(xù)性HCV感染是發(fā)展成肝細胞癌(HCC)的主要危險因素。當前在丙型肝炎的預(yù)防和治療中存在著一些問題，如HCV疫苗研究尚未獲得突破進展;耐藥問題嚴重，急需新型的抗HCV藥物。HCV研究主要障礙是缺乏合適的細胞模型及小動物模型。這極大的限制了HCV致病機制的研究及其藥物防治。
　　 HCV core蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的致病性方面具有重要作用;HCV非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，則更

2、多在病毒的復(fù)制、多蛋白產(chǎn)物的切割、HCV與宿主細胞間相互作用等過程中發(fā)揮重要作用，因此研究HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的作用機制，利用這些蛋白作為靶點篩選新藥具有重要的理論意義和實用價值。
　　 斑馬魚屬脊椎動物，其生長發(fā)育過程、組織系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人有很高的相似性，兩者在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上也具有很高的保守性，因此斑馬魚是研究人類疾病發(fā)生機理的優(yōu)良模式動物。斑馬魚具有個體小、養(yǎng)殖成本低的優(yōu)點，是高通量藥物篩選的脊椎動物模型。利用突變體或轉(zhuǎn)

3、基因魚，或野生型斑馬魚均可較方便地進行小分子化合物的篩選，篩選出的化合物可用做進一步的臨床測試。因此，本實驗嘗試利用斑馬魚建立HCV復(fù)制模型。
　　 本研究以斑馬魚作為模式動物，運用基因重組和分子生物學(xué)方法，獲得兩種斑馬魚HCV亞復(fù)制子模型:斑馬魚順式HCV亞復(fù)制子模型和斑馬魚反式HCV亞復(fù)制子模型。
　　 斑馬魚順式HCV亞復(fù)制子模型。利用小鼠肝核因子基因HNF4a啟動子調(diào)控下游基因表達，順序連接HCV5｀NTR-co

4、re、腦心肌炎病毒內(nèi)核糖體進入位點IRES、報告基因EGFP和HCV IRES-NS5B-3｀NTR基因序列，構(gòu)建了HCV亞復(fù)制子基因表達構(gòu)件pHHIGI5B。將此構(gòu)件顯微注射斑馬魚受精卵，經(jīng)HNF4a啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，由于此構(gòu)件含有HCV的5｀NTR、core、NS5B和3｀NTR，具備了HCV病毒的亞復(fù)制子結(jié)構(gòu)，因此，該mRNA可做為復(fù)制模板，在HCV RNA依賴的RNA聚合酶(NS5B)的作用下，產(chǎn)生負鏈的亞復(fù)制子RNA。熒

5、光顯微鏡下可觀察到EGFP熒光在肝臟區(qū)域的表達。western-blot可檢測到21kD core蛋白帶和NS5B蛋白條帶。RT-PCR可檢測出亞復(fù)制子負鏈RNA的存在，說明注射該基因構(gòu)件的斑馬魚體內(nèi)存在HCV亞復(fù)制子的復(fù)制過程。原位雜交實驗也進一步證實斑馬魚幼體肝區(qū)存在亞復(fù)制子負鏈RNA。綜上，斑馬魚順式HCV亞復(fù)制子模型是成功的。
　　 斑馬魚反式HCV亞復(fù)制子模型。該模型通過向斑馬魚受精卵共注射兩種HCV基因表達質(zhì)粒而組成

6、，pIresDsRed-5B可在CMV啟動子調(diào)控下分別表達HCV RNA聚合酶(NS5B)蛋白和紅色熒光蛋白;pRVIresCore-GFP-3N構(gòu)件可在CMV啟動子調(diào)控下分別產(chǎn)生反義的HCV5｀NTR-core和IRES-EGFP轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(antisense-transcripts)，以及正鏈HCV3'NTR。當由pIresDsRed-5B轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生NS5B(HCV RNA-dependant RNA polymerase)時，由pRV

7、IresCore-GFP-3N轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的反義RNA就能夠作為復(fù)制模板，在RNA依賴的RNA聚合酶(NS5B)作用下復(fù)制產(chǎn)生互補的mRNA，并被翻譯成EGFP和core蛋白。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可以在同一條斑馬魚幼體肝區(qū)觀察到綠色熒光和紅色熒光，可直觀地證明該亞復(fù)制子復(fù)制過程的存在。 RT-PCR驗證了復(fù)制產(chǎn)物—正鏈HCV5｀NTR-core-IRES-EGFP-HCV3'NTR的存在。Western blot結(jié)果進一步證實了core

8、和NS5B蛋白(來自復(fù)制產(chǎn)生的mRNA)在共注射斑馬魚體內(nèi)的表達。此外，利用原位雜交技術(shù)，EGFP和core的正義和反義RNA探針均在斑馬魚幼體肝區(qū)檢測到陽性信號;NS5B的反義探針也檢測到陽性信號，并且信號主要集中在斑馬魚的肝臟區(qū)域。而對照組（只注射了pRVIresCore-GFP-3N基因構(gòu)件）由于缺少HCV RNA聚合酶，由CMV啟動子轉(zhuǎn)錄出的反義的RNA不能被“復(fù)制”產(chǎn)生互補的mRNA，也未產(chǎn)生HCV Core和GFP蛋白。綜上

9、所述，我們成功構(gòu)建了HCV反式亞復(fù)制子斑馬魚模型。
　　 我們利用RT-PCR檢測了兩種亞復(fù)制子注射的斑馬魚幼體中HCV感染容易引起肝臟病變的一些基因markers的表達變化，乙酰輔酶A羧化酶(Ace)、類肝素酶(heparanase)在注射的斑馬魚幼體的表達水平明顯升高，表明斑馬魚幼體肝細胞已開始發(fā)生脂肪變性。提示HCV亞復(fù)制子導(dǎo)入斑馬魚肝臟后，不僅具有復(fù)制功能，還可導(dǎo)致肝臟發(fā)生類似人體和哺乳類動物模型的HCV病變。這些結(jié)果表

10、明，這兩種斑馬魚HCV復(fù)制模型是成功的。用抗HCV陽性藥物利巴韋林(ribavirin)、候選藥物苦參素(Oxymatrine)及其類似物DM-122對斑馬魚亞復(fù)制子模型進行驗證。在反式亞復(fù)制子模型中，加入利巴韋林后core的正義RNA明顯降低，并呈劑量依賴性，而反義RNA則無明顯變化，說明利巴韋林主要抑制core的正義RNA產(chǎn)生，即抑制復(fù)制的過程?？鄥⑺睾虳M-122也都呈劑量依賴性抑制core的正義RNA產(chǎn)生，對core的反義RNA