中國人HCV1b型雙順反子亞基因組復(fù)制子的構(gòu)建.pdf

1、背景和目的：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是丙型肝炎的致病體，丙型肝炎是世界范圍內(nèi)的重要傳染病之一。據(jù)估計(jì)，目前全世界約有1億7千萬HCV感染者，其中55-85％發(fā)展成慢性丙型肝炎，在10~20年中又有20％～50％進(jìn)展成肝硬化，1％～4％發(fā)展成肝細(xì)胞肝癌，所以丙型肝炎為一全球性嚴(yán)重危害人民健康的疾病。目前對HCV的預(yù)防和治療十分有限，迄今還沒有疫苗問世。HCV感染者最有效的治療方法為聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋

2、林，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率可達(dá)54％～56％，但該療法對基因型有很強(qiáng)的依賴性，即不同的基因型對治療反應(yīng)差異很大。此外，其治療費(fèi)用頗高，且具有顯著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治療方法?？笻CV藥物開發(fā)的主要障礙在于缺乏高效的體外HCV復(fù)制細(xì)胞模型和小動(dòng)物模型。HCV感染性分子克隆的體外轉(zhuǎn)錄物在黑猩猩體內(nèi)獲得有效的復(fù)制，而在人肝癌細(xì)胞系中復(fù)制效率較低。近年報(bào)道的選擇性雙順反子(cistron:編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的一個(gè)DNA單位)亞基因組HCVR

3、NA復(fù)制子(replicon:基因組中一個(gè)能被獨(dú)立復(fù)制的DNA片段單位)系統(tǒng)為HCV致病機(jī)理研究及抗病毒藥物評價(jià)提供了一個(gè)新的途徑。 HCV是黃病毒家族成員之一，基因組為單鏈正義RNA，長約9.6kb，HCV基因組具有明顯的異質(zhì)性，根據(jù)其核基酸( nucleotide，nt)序列的差異，分為6個(gè)主要的基因型(30-50％ nt差異)，50多個(gè)亞型(10-30％ nt差異)及不同的HCV分離株(5-15％ nt差異)，此外，HC

4、V以一群不同的但密切相關(guān)的變異株存在于患者體內(nèi)，稱為準(zhǔn)種( Quasispecies)。不同國家、不同地區(qū)的主要型別是不同的。在全球范圍內(nèi)，1-3型最為常見，1a在南美、北美、歐洲和亞洲占優(yōu)勢，1b型在北美、歐洲以及亞洲的一些地區(qū)較為多見，2a和2b型多分布于發(fā)展中國家，但是其流行程度次于1型。因此，采用HCV分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”法-核苷酸序列分析法調(diào)查中國人HCV基因型的分布狀態(tài)，以獲得中國人的HCV流行株，對于復(fù)制子的構(gòu)建以及后期抗病毒

5、藥物的篩選和評價(jià)具有重要意義。此外，由于HCV基因組富含GC且具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，長鏈的擴(kuò)增比較困難，國內(nèi)外大多數(shù)HCV全長基因組質(zhì)粒采用短鏈RT-PCR方法制備，涉及到許多亞基因組cDNA片段的克隆和連接，這種短片斷的拼接很容易造成準(zhǔn)種間的不同變異株的重組擴(kuò)增和不真實(shí)連接，使所構(gòu)建的HCV全基因組并不是實(shí)際存在的基因序列，限制了HCV分子水平的研究。同時(shí)最近研究顯示，HCV3’非編碼區(qū)(3'non-translated region，

6、3'UTR)是HCV基因組包裝和復(fù)制不可缺少的重要成分。HCV3'UTR位于HCV3'末端，包括一個(gè)基因型特異的多變區(qū)(不同基因型之間具有核苷酸序列的差異)、長度不一的多聚嘧啶區(qū)( poly U)及一段高度保守的98個(gè)堿基的區(qū)域，稱為X-tail。研究顯示完整的3'UTR才能發(fā)揮正常作用，不同型別甚至同型別不同株型間3'UTR的互換都會導(dǎo)致HCV RNA無法復(fù)制，刪除整個(gè)poly U或X-tail或X-tail中任何一個(gè)莖環(huán)均可徹底阻斷

7、HCV RNA復(fù)制。因此采用長鏈RT-PCR方法構(gòu)建包括完整3'UTR的HCV全長基因組質(zhì)?？勺畲笙薅鹊乇苊鉁?zhǔn)種間不真實(shí)連接，為HCV分子水平的研究提供更為真實(shí)可靠的研究平臺。 本研究收集西南地區(qū)HCV感染者的血液標(biāo)本及臨床資料，建立了HCV的標(biāo)本庫；采用HCV核苷酸序列分型法(sequence analysis)和系譜分析法(phylogenetic analysis)對西南地區(qū)206例HCV感染者進(jìn)行基因分型，了解HCV的主

8、要流行基因亞型；用主要流行株感染的血清及兩片段法逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR( RT-nested PCR)來構(gòu)建HCV全長基因組；以該全長質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得完整的HCV NS3至3'UTR長片斷，替代pNNeo/3-5B中HCV非結(jié)構(gòu)蛋白序列，構(gòu)建中國人HCV株選擇性雙順反子亞基因組RNA復(fù)制子質(zhì)粒；體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，將其轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，并進(jìn)行G418篩選，然后對集落細(xì)胞HCV復(fù)制子復(fù)制能力及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。 材料和方法：

9、 1.HCV感染患者血清標(biāo)本庫的建立：從2004年開始，我們系列地收集了西南醫(yī)院傳染科門診及住院的HCV感染患者血液標(biāo)本。所有血清標(biāo)本進(jìn)行基本的生化和病毒學(xué)檢測。記錄每一位患者的流行病學(xué)資料和臨床與診斷檢測結(jié)果。定期隨訪，不斷擴(kuò)充標(biāo)本庫。同時(shí)，對大部分HCV RNA陽性血清標(biāo)本進(jìn)行HCV基因型別的檢測，以GenBank中所有HCV全長序列為參照序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增HCV C區(qū)基因的羧基端至El區(qū)基因的氨基端長度為474bp的片段，測定其

10、核苷酸序列，與GenB ank中已知的HCV序列進(jìn)行系譜分析，進(jìn)行HCV基因型和亞型的確定。 2.HCV長鏈RT-PCR擴(kuò)增方法的建立和優(yōu)化：選擇病毒含量較高的患者血清標(biāo)本進(jìn)行5'和3'半基因組擴(kuò)增。以GenB ank中所有HCV全長序列為參照序列，選擇相對保守，GC含量適中的區(qū)域設(shè)計(jì)RT引物和PCR擴(kuò)增引物，由于3'半基因組擴(kuò)增難度較大，特別設(shè)計(jì)了6條正向引物和2條反向引物。通過對HCV RNA提取方法的篩選、三種RT酶及RT

11、條件，以及PCR引物、不同高保真Taq酶、循環(huán)體系、循環(huán)條件的比較和優(yōu)化，建立HCV長鏈RT-PCR擴(kuò)增方法。 3.中國人HCV雙順反子亞基因組復(fù)制子的構(gòu)建：選擇一例1b型且HCV RNA含量較高的血清標(biāo)本，通過優(yōu)化的RT-PCR擴(kuò)增方法及融合PCR方法獲得HCV全長基因組片斷，TA克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞獲得HCV全長基因組質(zhì)粒。以該全長質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得完整的HCV NS3至3'UTR長片斷，替代pNNeo/3- SB中HCV

12、非結(jié)構(gòu)蛋白序列，構(gòu)建中國人HCV株選擇性雙順反子亞基因組RNA復(fù)制子質(zhì)粒。提取復(fù)制子質(zhì)粒DNA，Xba I限制性內(nèi)切酶對其酶切線性化，體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，并進(jìn)行G418篩選，獲得抗性克隆。提取克隆細(xì)胞的RNA和蛋白，進(jìn)行短鏈RT-PCR、間接免疫熒光法及Western blot檢測HCV復(fù)制子是否進(jìn)行了有效復(fù)制及蛋白表達(dá)。 主要結(jié)果： 1.建立了中國人HCV標(biāo)本庫：至今為止，已收集605例HCV慢性感染

13、患者的934份血清標(biāo)本。完整記錄了流行病學(xué)、臨床及實(shí)驗(yàn)室資料，可提供研究所需的血清標(biāo)本。對206份HCV RNA陽性感染者血清標(biāo)本進(jìn)行了基因型別的檢測。序列與系譜分析結(jié)果顯示1b87例，占42.2％，2a26例，占12.6％，3a32例，占15.5％，3b30例，占14.6％，6a31例，占15.1％，未見1a和2b型，1b為我國流行的主要基因型。 2.建立了HCV長鏈RT-PCR擴(kuò)增方法：選擇SuperScriptTM IIR

14、Nase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和Platinum Taq DNA高保真Taq酶以及最佳的逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)條件可成功實(shí)現(xiàn)HCV5'端和3'端半基因組的擴(kuò)增。HCV5'端半基因組擴(kuò)增較為穩(wěn)定，通常HCV RNA定量>106的血清標(biāo)本擴(kuò)增均可獲得陽性條帶，目的條帶亮度高，特異性好；3'端半基因組擴(kuò)增重復(fù)性和靈敏度有待進(jìn)一步提高。 3.成功地構(gòu)建了中國人HCVlb型選擇性雙順反子亞基因組RNA復(fù)制子：通過優(yōu)化的RT-PCR及融合PCR方法獲得

15、了HCV全長基因組片斷及質(zhì)粒，CE1和3'端短鏈擴(kuò)增均可獲得陽性結(jié)果。以該全長質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得完整的HCV NS3至3'UTR長片斷，替代pNNeo/3-5B中HCV非結(jié)構(gòu)蛋白序列，成功構(gòu)建了中國人HCV株選擇性雙順反子亞基因組RNA復(fù)制子質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA體外轉(zhuǎn)錄合成得到RNA，電泳顯示片斷大小正確，濃度較高。將其轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，G418篩選，經(jīng)過45天左右的時(shí)間，獲得G418抗性克隆。RT-PCR可以獲得陽性條帶，證明復(fù)制子RN

16、A可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制；間接免疫熒光及Western blot檢測均獲得陽性結(jié)果，表明有HCV NS3和NS5A蛋白表達(dá)，結(jié)果證明中國人HCV亞基因組復(fù)制子構(gòu)建成功。 主要結(jié)論： 1.建立了中國人HCV標(biāo)本庫。為HCV的基礎(chǔ)與臨床研究奠定了良好的基礎(chǔ)。 2.建立了HCV長鏈RT-PCR擴(kuò)增方法。、為HCV全基因組質(zhì)粒及體外復(fù)制子模型的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)，也為其他RNA病毒的長鏈擴(kuò)增提供了參考。 3.成功建立了