miR-193a影響B(tài)VDV在牛胞內(nèi)復(fù)制的分子機制研究.pdf

1、關(guān)于BVDV引起的持續(xù)性感染發(fā)生的分子機制尚未研究清楚，最關(guān)鍵的是BVDV與宿主細胞之間相互作用關(guān)系尚未系統(tǒng)性闡述。大量研究表明，當(dāng)病毒入侵機體細胞，機體細胞會主動誘發(fā)凋亡，或凋亡被誘導(dǎo)，進而導(dǎo)致被感染細胞的死亡以及病毒的清除。本實驗室前期的實驗中使用solexa高通量測序檢測了BVDV感染靶細胞MDBK后的差異表達譜顯示：miR-193a的表達量顯著性升高，且通過生物信息學(xué)軟件分析miR-193a靶向凋亡通路中的相關(guān)基因Bax。所以本

2、研究以miR-193a為研究對象，探究miR-193a作用于靶蛋白，影響凋亡和BVDV復(fù)制的分子機制，進而為闡述BVDV的持續(xù)性感染和BVDV防控新方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：探究miR-193a靶向凋亡通路靶蛋白，進而影響凋亡和BVDV復(fù)制的分子機制。
　　方法：⑴依據(jù)本實驗室前期高通量測序結(jié)果，選擇了顯著性上調(diào)表達的miR-193a進行后續(xù)實驗；⑵擴增miR-193a前體及其抑制劑pre-miR-193a-IN，并克隆

3、至慢病毒pll3.7載體中；包裝慢病毒，感染MDBK細胞；利用 qRT-PCR檢測過表達和抑制 miR-193a的作用效果；⑶轉(zhuǎn)染 miR-193a的模擬物和抑制劑進入MDBK細胞，qRT-PCR檢測BVDV的復(fù)制水平；⑷使用生物信息軟件預(yù)測miR-193a的靶基因，構(gòu)建pmirGLO-Bax3’UTR重組熒光載體，與pll3.7-miR-193載體共轉(zhuǎn)染至 MDBK細胞，使用熒光分光光度計驗證 miR-193a直接靶向靶基因；⑸過表達

4、和抑制miR-193a后qRT-PCR檢測Bax的轉(zhuǎn)錄水平，Western blot檢測Bax蛋白表達量并使用流式細胞儀檢測凋亡率；⑹利用Methprimer軟件于 pre-miR-193a上游設(shè)計啟動子引物，擴增并克隆至熒光素酶載體pGL3-Basic中，使用熒光分光光度計檢測可能的啟動子；⑺根據(jù)可能的啟動子區(qū)域設(shè)計甲基化檢測引物，使用亞硫酸鹽修飾處理的 BVDV感染和未感染的MDBK細胞全基因組DNA為模板擴增并克隆至T載體中，甲基

5、化測序后分析結(jié)果；⑻設(shè)計干擾甲基化位點的shRNA，構(gòu)建shRNA-慢病毒重組載體，包裝慢病毒并侵染MDBK后提取全基因組，經(jīng)亞硫酸鹽處理后為模板擴增并克隆至T載體，甲基化測序后分析甲基化程度；⑼檢測不同的shRNA-慢病毒處理后，miR-193a的表達水平。
　　結(jié)果：①過表達pre-miR-193a慢病毒處理后能顯著性上調(diào)miR-193a的表達；相反，過表達 pre-miR-193a-IN慢病毒處理后能顯著性下調(diào) miR-19

6、3a的表達；②qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-193a模擬物后的BVDV復(fù)制水平顯著性降低，即過表達miR-193a能抑制BVDV的復(fù)制；③雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-193a能直接靶向于 Bax蛋白，并抑制 Bax的表達；④流式細胞儀檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pll3.7-pre-miR-193a的MDBK細胞凋亡率顯著性上升；Western blotting檢測顯示Bax表達下調(diào)，即miR-193a能靶向凋亡相關(guān)基因Bax，并促進細胞凋亡；⑤

7、成功構(gòu)建了pGL3-Basic-gene熒光素酶重組載體，并利用熒光分光光度計驗證可能的啟動子區(qū)域為miR-193a-P4；⑥利用軟件成功分析了甲基化的程度顯示：BVDV感染的MDBK細胞內(nèi)miR-193a啟動子區(qū)域的甲基化程度比未感染BVDV的MDBK細胞下調(diào)19％，證明BVDV感染導(dǎo)致miR-193a啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化；⑦甲基化測序檢測shRNA-慢病毒感染的MDBK細胞中miR-193a啟動子區(qū)域甲基化程度的結(jié)果顯示：pll3

8、.7-193a-promoter shRNA-2慢病毒處理后顯著性降低甲基化程度，而且增加了miR-193a的表達，此段區(qū)域最可能為miR-193a的啟動子；⑧熒光定量PCR結(jié)果顯示pll3.7-193a-promoter shRNA-2慢病毒處理后miR-193a表達水平最高。
　　結(jié)論：⑴miR-193a可作用于促凋亡基因Bax誘發(fā)細胞凋亡，細胞在凋亡發(fā)生時形成凋亡小體，吞噬細胞將凋亡小體吞噬，進而發(fā)揮溶酶體的融合和降解作用，

9、最終將BVDV病毒降解并清除，miR-193a就抑制了BVDV的復(fù)制。⑵預(yù)測并初步鑒定了miR-193a的可能的啟動子區(qū)域為miR-193a-P4；在BVDV感染后可能導(dǎo)致了 miR-193a啟動子區(qū)域的去甲基化，從而調(diào)控 miR-193a的表達上調(diào)；pll3.7-193a-promoter shRNA-2慢病毒能顯著性降低甲基化程度，進而增加miR-193a的表達，更精確了miR-193a的可能的啟動子區(qū)域，為有效調(diào)控miR-193a