Stx2噬菌體ФMin27溶原影響宿主大腸桿菌的分子機(jī)制.pdf

1、大腸桿菌O157為重要的食源性病原菌，其主要毒力因子之一是志賀毒素（Shiga toxin），編碼志賀毒素的噬菌體為志賀毒素噬菌體（Stx噬菌體）。Stx噬菌體的溶原可使宿主菌產(chǎn)生Stx毒素，導(dǎo)致細(xì)菌致病力增強(qiáng)。此外 Stx噬菌體溶原與宿主菌之間還會(huì)產(chǎn)生哪些相互影響還不是很清楚。本研究以Stx2噬菌體ΦMin27為研究對(duì)象，試圖揭示Stx2噬菌體溶原與宿主菌之間的相互調(diào)控作用，為防控產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌特別是大腸桿菌O157提供一定的理論

2、依據(jù)。
　　1. Stx2噬菌體溶原感染對(duì)宿主大腸桿菌MG1655蛋白表達(dá)的影響
　　通過(guò)噬菌體溶原感染和二維電泳（2-Dimensional electrophoresis，2DE）研究Stx2噬菌體ΦMin27溶原對(duì)大腸桿菌MG1655蛋白表達(dá)的影響。采用雙層瓊脂法及PCR技術(shù)驗(yàn)證獲得穩(wěn)定的純化溶原株 MG1655ФMin27。采用二維電泳技術(shù)，對(duì)野生株MG1655和溶原株MG1655ФMin27在相同生長(zhǎng)條件下的全蛋白

3、表達(dá)譜進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異的點(diǎn)有65個(gè)，選擇其中的32個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定（LC-MS/MS），其中有四種蛋白均與F eS合成亞單位相關(guān)，即NfuA、FdoH、SdhB和 FtnA蛋白。為進(jìn)一步論證二維電泳檢測(cè)結(jié)果的可靠性，選擇了大腸桿菌的4個(gè)差異表達(dá)蛋白基因（nfuA、fdoH、sdhB和 ftnA）進(jìn)行熒光定量 PCR（RT-PCR）驗(yàn)證，分析結(jié)果與全蛋白二維電泳得到的結(jié)果一致。本研究探索了噬菌體ΦMin27溶原感

4、染前后大腸桿菌宿主MG1655蛋白表達(dá)的變化，為進(jìn)一步了解噬菌體與宿主菌的相互作用提供了參考數(shù)據(jù)。
　　2. nfuA、fdoH、sdhB和ftnA基因缺失株及其溶原株的構(gòu)建以及鐵離子對(duì)其生長(zhǎng)特性的影響
　　在二維電泳和蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果中，有四個(gè)差異表達(dá)蛋白NfuA、FdoH、SdhB和FtnA均與FeS合成亞單位相關(guān)，為此進(jìn)一步探索其在Stx噬菌體溶原中的作用及鐵離子代謝對(duì)噬菌體溶原產(chǎn)生的影響。利用λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)

5、，構(gòu)建了大腸桿菌 MG1655的缺失株 MG1655△nfuA、MG1655△fdoH、MG1655△sdhB和MG1655△ftnA，并將nfuA片段、fdoH片段、sdhB片段和ftnA片段與pUC18質(zhì)粒連接，然后分別轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的突變株，得到相應(yīng)的互補(bǔ)菌株。將Stx2噬菌體ΦMin27感染各缺失突變株，獲得相應(yīng)的溶原菌株。
　　隨后測(cè)定了野生株、溶原株、缺失株和互補(bǔ)株分別在普通 LB液體培養(yǎng)基及缺鐵（添加鐵螯合劑2，2’-聯(lián)

6、吡啶（DPD））和富鐵（添加FeCl3）狀態(tài)下的生長(zhǎng)曲線，研究鐵離子對(duì)各菌株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明在普通LB液體培養(yǎng)基中，nfuA及sdhB基因缺失對(duì)MG1655的生長(zhǎng)抑制較大，fdoH及ftnA缺失株溶原前后生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異，nfuA缺失株溶原后菌株生長(zhǎng)要稍稍滯后于未溶原株，而 sdhB缺失突變株溶原 Stx2噬菌體ΦMin27后菌株生長(zhǎng)顯著快于未溶原株。250μM DPD和500μM FeCl3對(duì)野生株MG1655的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

7、在缺鐵條件下（250μM DPD），fdoH和ftnA缺失株與野生株生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，但nfuA和sdhB缺失株對(duì)鐵離子缺乏比較敏感。在相應(yīng)的ΦMin27噬菌體溶原株中，fdoH和ftnA缺失溶原株與野生株在缺鐵（250μM DPD）和富鐵（500μM FeCl3）條件下的生長(zhǎng)均無(wú)明顯差異。然而，不論是在普通 LB肉湯中還是在缺鐵或富鐵環(huán)境中，sdhB缺失溶原株（MG1655△sdhBΦMin27）均比野生溶原株（MG1655ΦMin27

8、）生長(zhǎng)更好。相反地，nfuA缺失溶原株（MG1655△nfuAΦMin27）在普通 LB肉湯中比野生溶原株（MG1655ΦMin27）生長(zhǎng)要慢，補(bǔ)充Fe3+可彌補(bǔ)這種生長(zhǎng)差異。而鐵螯合劑DPD的添加會(huì)促進(jìn)這種生長(zhǎng)差異，且DPD濃度越大，nfuA缺失溶原株生長(zhǎng)抑制越明顯，可見(jiàn)nfuA在噬菌體溶原株中發(fā)揮了重要作用。
　　3.大腸桿菌nfuA在Stx2噬菌體ΦMin27溶原穩(wěn)定性中的作用
　　為進(jìn)一步探索大腸桿菌nfuA在Stx

9、噬菌體溶原菌中所發(fā)揮的作用，對(duì)nfuA突變?nèi)茉赀M(jìn)行進(jìn)一步的研究。為驗(yàn)證nfuA缺失溶原株是否發(fā)生了噬菌體自發(fā)誘導(dǎo)，在噬菌體未誘導(dǎo)狀態(tài)下檢測(cè)了溶原菌培養(yǎng)上清液中噬菌體以及 Stx2毒素。結(jié)果顯示，缺鐵條件下（250μM DPD），存在于nfuA缺失溶原株培養(yǎng)上清液中的噬菌體達(dá)到了106 PFU/m l以上，顯著高于野生溶原株和其他突變?nèi)茉?。相?yīng)地，在Stx2對(duì)Vero細(xì)胞的毒性檢測(cè)中，nfuA缺失溶原株上清液中的Stx2毒性也明顯高于

10、其他各突變?nèi)茉?。同時(shí)對(duì)大腸桿菌O157:H7 Min27進(jìn)行了nfuA基因缺失株的構(gòu)建，并檢測(cè)了其培養(yǎng)上清液中噬菌體以及Stx2，得到了一致的結(jié)果。為了驗(yàn)證噬菌體是否進(jìn)入了裂解周期，采用qRT-PCR檢測(cè)了與裂解周期相關(guān)的調(diào)控蛋白編碼基因cI、cII、cIII和cro在nfuA缺失和缺鐵條件下的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：在鐵螯合劑DPD（250μM）存在條件下，與野生溶原株相比，nfuA缺失溶原株cro基因表達(dá)水平上調(diào)了9倍以上，c

11、I、cII和cIII基因表達(dá)水平下調(diào)了5～20倍。因此，nfuA的缺失影響了與噬菌體溶原生命周期相關(guān)的基因表達(dá)，促使噬菌體進(jìn)入了裂解周期，在缺鐵條件下，這種現(xiàn)象更為顯著。推測(cè)nfuA在維持噬菌體溶原中發(fā)揮了極其重要的作用，可維持菌株中的噬菌體保持溶原狀態(tài)。
　　4. Stx2噬菌體溶原對(duì)大腸桿菌運(yùn)動(dòng)性及其相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因缺失和噬菌體溶原轉(zhuǎn)換研究大腸桿菌運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因flhDC、fliA、fliD和fliE

12、對(duì)Stx2噬菌體ΦMin27溶原菌的影響。同時(shí)利用Red重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了大腸桿菌 MG1655的缺失株 MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD及MG1655△fliE，并將目的片段分別與pUC18質(zhì)粒連接，然后分別轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的突變株，得到相應(yīng)的互補(bǔ)菌株。通過(guò)Stx2噬菌體ΦMin27的感染獲得各缺失株的溶原株。隨后測(cè)定了各菌株的運(yùn)動(dòng)能力，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了f lhD C缺失對(duì)溶原菌和野生株幾個(gè)

13、運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：ΦMin27溶原可增強(qiáng)大腸桿菌MG1655的fliA和 fliD基因的表達(dá)，提高菌株MG1655運(yùn)動(dòng)能力；flhDC基因缺失增強(qiáng)了fliA和fliD基因的表達(dá)，但未改變菌株運(yùn)動(dòng)特性；而MG1655△flhDC溶原菌則不具有運(yùn)動(dòng)能力，基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果顯示MG1655△flhDC溶原ΦMin27后，顯著抑制了fliA和fliD基因的表達(dá)，但并未影響 fliE基因的表達(dá)。fliA、fliD和 fliE單