PEDV感染豬空腸組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及hnRNP A1影響PEDV復(fù)制的作用機(jī)制研究.pdf

1、近年來，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株引起的新型豬流行性腹瀉在世界范圍內(nèi)暴發(fā)，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，當(dāng)前防控手段的匱乏無法應(yīng)對PED帶來的威脅。因此，研究PEDV的致病機(jī)理以及開發(fā)抗PEDV藥物對PED的防控和治療具有深遠(yuǎn)的意義。
　　本研究基于iTRAQ技術(shù)，開展了PEDV強(qiáng)毒株及其傳代致弱毒株感染仔豬空腸組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為揭示PEDV的致病機(jī)理和宿主的免疫應(yīng)答提供參考。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果

2、，研究了hnRNP A1和PEDVN蛋白的互作關(guān)系，為揭示PEDV的復(fù)制過程提供參考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并闡明了其抗病毒機(jī)理，為PEDV的治療和相關(guān)藥物的開發(fā)提供了參考。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.PEDV強(qiáng)毒株及其致弱毒株感染仔豬空腸的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　本研究使用iTRAQ定量蛋白質(zhì)技術(shù)結(jié)合液相二級質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)，研究了PEDV強(qiáng)毒株及其傳代致弱毒株感染仔豬空腸的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。在強(qiáng)毒株YN13株

3、感染組和弱毒YN144感染組分別鑒定到269和301個(gè)差異表達(dá)蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要涉及應(yīng)激反應(yīng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等過程。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PEDV感染可以導(dǎo)致多種干擾素刺激基因的上調(diào)表達(dá)，表明PEDV感染會(huì)誘導(dǎo)宿主的先天性免疫過程。通過對比分析兩感染組的蛋白，發(fā)現(xiàn)許多熱激蛋白家族成員和一些轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)因子在兩組中呈現(xiàn)不同的表達(dá)情況，提示這可能是造成兩毒株致病性差異的因素。
　　2.核不均一蛋白A1（hnRNP A

4、1）參與PEDV的復(fù)制過程
　　根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)hnRNP A1在兩病毒感染組表現(xiàn)為不同的表達(dá)情況，提示該蛋白的變化可能會(huì)造成病毒致病力的變化。首先研究了該蛋白在細(xì)胞中定位情況，通過共聚焦試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位，表明兩者之間存在互作關(guān)系。使用免疫共沉淀技術(shù)，進(jìn)一步確認(rèn)了兩者之間的互作關(guān)系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位區(qū)主要位于核周，而核周是冠狀病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體存在的位置，提示hnRNP A

5、1可能參與了該復(fù)合體的組成，進(jìn)而參與了PEDV的復(fù)制過程。為了驗(yàn)證hnRNP A1是否參與了PEDV的復(fù)制過程，通過siRNA沉默hnRNP A1的表達(dá)，而后使用不同PEDV毒株感染。通過間接免疫熒光試驗(yàn)、熒光定量RT-PCR和Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hnRNP A1沉默后，PEDV的基因組、PEDV感染的細(xì)胞數(shù)量以及PEDV N蛋白的表達(dá)量都顯著減少，說明hnRNP A1參與了PEDV的復(fù)制過程。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，推測hnR

6、NP A1在YN144感染組的下調(diào)表達(dá)是造成兩病毒毒力差異的原因之一。
　　3.槲皮素抗PEDV研究
　　通過間接免疫熒光和Western blot試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以有效抑制PEDV的感染過程。首先研究了槲皮素對PEDV吸附和入侵過程的影響，發(fā)現(xiàn)其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero細(xì)胞，表明槲皮素抗PEDV的作用發(fā)生在病毒入侵宿主細(xì)胞之后。由于槲皮素是一種很好的HSPA1抑制劑，其可能通過抑制HSPA1發(fā)揮抗PEDV效果

7、。為驗(yàn)證此設(shè)想，使用siRNA沉默HSPA1的表達(dá)，然后再感染PEDV，通過熒光定量RT-PCR、間接免疫熒光和Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEDV的感染過程并未受到影響。表明槲皮素的抗病毒效果并不依賴其HSPA1抑制劑的活性。通過Docking分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以結(jié)合于PEDV3C樣蛋白酶的活性位點(diǎn)，表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表達(dá)純化了PEDV的3C樣蛋白酶，通過表面等離子共振(surface plasmon res