鴨坦布蘇病毒感染細胞蛋白質組學分析及DDX3X對復制的影響.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是一種近年新發(fā)的鴨感染性疾病，被感染的鴨群首先表現(xiàn)為采食量下降，接踵而至的是產(chǎn)蛋量下降，到發(fā)病第10天，產(chǎn)蛋量能降至平常產(chǎn)蛋量的10％以內(nèi)，該病死亡率在5-30％。其致病原鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬單股正鏈RNA病毒，除了能嚴重影響產(chǎn)蛋鴨、種鴨的生產(chǎn)性能外，還能感染肉鴨、鵝、雞、麻雀、野鳥、蚊子甚至小鼠等。由于其傳播速度快，傳播途徑尚不明了，感染宿主范圍廣，以及缺乏

2、足夠有效的藥物進行及時治療，已經(jīng)嚴重危害著我國水禽業(yè)的健康發(fā)展和人類公共衛(wèi)生安全。本研究采用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)蛋白質組學技術首次研究分析了DTMUV感染乳倉鼠腎(baby hamster kidney，BHK-21)細胞前后的差異表達蛋白，并且研究了DDX3X對DTMUV復制的影響。為更好地防控該病提供理論指導。

3、具體研究內(nèi)容如下:
　　1.DTMUV感染BHK-21細胞的蛋白質組學分析
　　為了研究DTMUV感染后宿主細胞蛋白表達變化的情況，本研究采用iTRAQ技術，并與高通量雙向高效液相色譜質譜(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS)聯(lián)用對DTMUV感染BHK-21細胞后24h和48h兩個時間點的蛋白表達情況進行了檢測和

4、分析。共鑒定到192個差異表達的宿主蛋白。與對照相比，DTMUV感染后24h，有11個顯著上調表達蛋白和8個顯著下調表達蛋白;DTMUV感染后48h，有25個顯著上調表達蛋白151個顯著下調表達蛋白。對差異表達蛋白進行包括基因本體論(Gene Ontology，GO)分析，京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，蛋白互作網(wǎng)絡等生物信息學分析，結果表明細

5、胞內(nèi)的差異表達蛋白涉及多個生物學過程、細胞組分和分子功能等，且隨著DTMUV的不斷復制，感染后48h的蛋白變化明顯多于感染后24h。因此選擇感染后48h的差異表達蛋白作進一步IPA（Ingenuity Pathway Anaylsis）分析和驗證。在所有差異表達蛋白當中，Toll樣受體9（Toll-like receptor9，TLR9）上調倍數(shù)最大，IPA分析其屬于抗微生物感染免疫蛋白互作網(wǎng)絡里的蛋白，而同在一個互作網(wǎng)絡里的RNA解旋

6、酶DDX3X(DEAD-box helicase3，X-linked)及其家族成員DDX5則下調表達。為了驗證蛋白質組學結果的可靠性，進一步通過熒光定量qRT-PCR和Western blot實驗對TLR9、DDX3X和DDX5的表達進行了檢測，結果與蛋白質組學結果一致。說明TLR9、DDX3X和DDX5可能參與了DTMUV的復制。
　　2.DDX3X對DTMUV復制的影響
　　為研究DDX3X對DTMUV復制的影響，本研究

7、從BHK-21細胞中克隆DDX3X基因并成功構建真核表達質粒3Flag-DDX3X。通過在BHK-21細胞中過表達或干擾DDX3X后用DTMUV感染細胞并檢測病毒復制水平，結果表明過表達DDX3X能抑制病毒的增殖，而干擾DDX3X則能促進病毒的增殖。而有報道人源DDX3X參與多種病毒的復制過程，在人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK293T）細胞內(nèi)能通過作用于TBK1調控Ⅰ干擾素通路而抑制同為黃病毒科的登草病毒

8、(Dengue virus，DENV)的復制，為了確定BHK-21細胞內(nèi)DDX3X是否也有類似作用，本研究采用聚肌胞苷酸poly(I∶C)刺激BHK-21細胞，然后用綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein，VSV-GFP）感染細胞，通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞計數(shù)的方法證明了細胞內(nèi)干擾素通路的存在。并且比對了人源和倉鼠源的DDX3X的氨基酸

9、序列，發(fā)現(xiàn)其相似度高達98.3％，接著將3Flag-DDX3X與人源TBK1基因真核表達質粒HA-TBK1同時轉染HEK293T細胞，通過免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)，倉鼠源DDX3X能夠與TBK1發(fā)生相互作用，進而又通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測了二者對β干擾素（Interferon-beta，IFN-β）啟動子活性的影響。與對照或單獨轉染HA-TBK1實驗組相比，倉鼠源DDX3X明顯促進了IFN-β啟動子活性，說明倉鼠源DDX3X能增強TBK1對

10、IFN-β啟動子的誘導。用同樣的方法處理HEK293T細胞，并用Trizol Reagent裂解細胞收取細胞總RNA，用熒光定量qRT-PCR檢測了在HEK293T細胞中IFN-β及下游基因的mRNA變化。結果顯示,同時轉染HA-TBK1和3Flag-DDX3X明顯促進了IFN-β及下游STAT1、OAS、Mx1、ISG15、ISG56基因的mRNA轉錄。進一步證實了倉鼠源DDX3X能通過TBK1增強對IFN-β的誘導，與人源DDX3X