補氣活血、清熱泄?jié)嶂兴巻误w對內(nèi)皮細胞骨架的影響及其調(diào)節(jié)機制.pdf

1、目的：
　　觀察毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素對LPS誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)的干預(yù)作用，探討三種中藥單體通過調(diào)控Rho/ROCK通路、AKT通路對內(nèi)皮細胞細胞骨架及通透性的影響，為其對內(nèi)皮細胞功能的保護作用提供實驗支持，同時為中醫(yī)采用補氣活血清熱泄?jié)岱ㄖ委焹?nèi)皮損傷相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先以0.2μg/ml LPS作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vei

2、n endothelial cells，HUVECs)24h，造成血管內(nèi)皮損傷模型。Y27632（ROCK特異性抑制劑）和纈沙坦（西藥對照，AngⅡ受體1拮抗劑，Rho/ROCK信號通路的間接抑制劑）作為陽性對照藥物。我們分別依次觀察了毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷后的HUVECs的變化:MTT法觀察細胞存活率、流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI染色觀察凋亡率，transwell觀察細胞遷移能力，10 mg

3、/mL波連蛋白預(yù)包被/無包被96孔板觀察細胞黏附能力，硝酸還原酶法觀察細胞培養(yǎng)上清中的cNOS、iNOS和NO濃度，免疫熒光觀察細胞骨架和黏著斑蛋白的結(jié)構(gòu)和分布。研究中，三種中藥單體都表現(xiàn)出卓越的內(nèi)皮細胞保護能力。
　　然后我們試圖對三種中藥單體的內(nèi)皮細胞保護機制進行探討。首先，以內(nèi)皮細胞生物學(xué)功能PCR基因芯片技術(shù)篩選可能的基因譜，發(fā)現(xiàn)細胞骨架重構(gòu)相關(guān)基因，如Rho/ROCK、AKT和FAK-PI3K信號通路相關(guān)基因在其中起重要

4、作用，尤以Rho/ROCK通路為主。結(jié)合基因芯片結(jié)果和文獻中各基因功能，擬定觀察Rho/ROCK通路中的關(guān)鍵基因如纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，整合素A5(integrin A5，ITGA5)，Ras同源基因家族成員(Ras homolog genefamily member A，RhoA)，肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸肌醇3-激酶(

5、phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate3-kinase，PI3K)，黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)，血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR2)的mRNA表達水平，進行實時定量PCR驗證，

6、同時以Western blotting對ITGA5，RhoA，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2)和磷酸化的肌球蛋白輕鏈(Phosphorylated myosin light chain，PMLC)進行蛋白水平的研究。
　　結(jié)果：
　　(1)LPS成功誘導(dǎo)構(gòu)建了HUVECs細胞骨架損傷模型。HUVECs細胞增殖減弱、凋亡增加，細胞骨架肌動蛋白皺縮、黏

7、著斑蛋白聚集，LPS活化內(nèi)皮、誘導(dǎo)肌球蛋白收縮，導(dǎo)致細胞間隙開放、內(nèi)皮通透性增加、細胞遷移能力和黏附能力下降。LPS作用24h后，cNOS減低，tNOS、iNOS、NO升高，呈現(xiàn)內(nèi)皮損傷和炎癥狀態(tài)。同時，LPS激活Rho/ROCK信號通路，提高Rho/ROCK通路相關(guān)基因、蛋白的表達(FN，ITG A5，RhoA，MLCP，PI3K FAK，VEGF，VEGFR2)。Y27632和纈沙坦特異性阻斷了Rho/ROCK通路，顯現(xiàn)出對細胞骨架

8、損傷的較強的保護作用。
　　(2)毛蕊異黃酮誘導(dǎo)HUVECs細胞凋亡、提高細胞遷移能力、降低黏附能力、cNOS升高、iNOS減低、細胞骨架和黏著斑蛋白形態(tài)和分布狀況改善，即減少細胞數(shù)量、提高細胞質(zhì)量。毛蕊異黃酮的內(nèi)皮保護作用涉及多條信號通路。毛蕊異黃酮通過增加NO的生成促進MLCP的激活，MLCP活化后降低PMLC，直接對抗Rho/ROCK通路的活化，同時通過降低VEGF、VEGF.R2和PI3K阻斷AKT信號通路，發(fā)揮其內(nèi)皮保護

9、作用。
　　(3)丹參酮ⅡA抑制HUVECs細胞凋亡、改善了細胞骨架肌動蛋白和黏著斑蛋白的形態(tài)和分布狀況、提高細胞遷移和黏附能力，提高cNOS濃度。丹參酮ⅡA是內(nèi)皮細胞強保護劑，其機制主要是通過下調(diào)ITG A5的表達而阻斷Rho/ROCK通路的激活。
　　(4)大黃素誘導(dǎo)HUVECs細胞凋亡、提高細胞遷移能力和黏附能力、cNOS升高、iNOS減低，但對細胞骨架和黏著斑蛋白基本沒有改善作用。大黃素的內(nèi)皮保護作用復(fù)雜，涉及多條信

10、號通路，通過輕度抑制Rho/ROCK通路、調(diào)節(jié)AKT和/或FAK-PI3K信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)保護作用。
　　結(jié)論：
　　(1)LPS誘導(dǎo)了HUVECs細胞骨架損傷，毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素通過穩(wěn)定細胞骨架結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)凋亡率、調(diào)節(jié)細胞合成和利用NO的能力、改變細胞遷移和黏附能力，而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性、改善內(nèi)皮屏障功能。
　　(2)丹參酮ⅡA抑制HUVECs凋亡，毛蕊異黃酮和大黃素促進HUVECs凋亡，維持調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞數(shù)

11、量的穩(wěn)定。
　　(3)三種中藥單體對細胞骨架的保護機制分別涉及多個信號通路和信號通路間的串話，以Rho/ROCK信號通路為最主要的調(diào)節(jié)通路，還涉及AKT和/或FAK-PI3K通路，及其彼此間的串話。毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素均參與了Rho/ROCK通路的調(diào)節(jié)，其中，毛蕊異黃酮同時還通過降低VEGF、VEGF.R2和PI3K阻斷AKT信號通路，發(fā)揮作用;丹參酮ⅡA以下調(diào)ITGA5的表達而阻斷Rho/ROCK通路的激活為主，同時也

12、經(jīng)PI3K和NO與其他通路互相協(xié)調(diào);大黃素的調(diào)節(jié)機制較為復(fù)雜，通過輕度抑制Rho/ROCK通路、調(diào)節(jié)AKT和/或FAK-PI3K信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)保護內(nèi)皮細胞的作用。
　　(4)雖然機制和過程不同，但三個中藥單體均顯示了對細胞骨架損傷后修復(fù)的調(diào)節(jié)功效和對內(nèi)皮細胞的保護作用。
　　研究意義：
　　本研究首次將中藥單體的內(nèi)皮保護機制與基因芯片技術(shù)聯(lián)系起來，從對細胞骨架損傷后修復(fù)、內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)節(jié)和機制的角度進行了研究。從