人促血液血管細(xì)胞生成素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：人促血液血管細(xì)胞生成素(HAPO)，是我們實(shí)驗(yàn)室從再生障礙性貧血病人尿中純化出的一種蛋白質(zhì)，基因序列比較發(fā)現(xiàn)它是一種新的細(xì)胞因子。HAPO基因的同源性分析(BLAST)結(jié)果表明，該因子是蛋白多糖4基因的一種新的剪接體。功能研究發(fā)現(xiàn)，HAPO在體外能明顯刺激人的造血及骨髓細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，而且HAPO主要作用于人的造血和血管內(nèi)皮干/祖細(xì)胞的早期階段，是一種早期生長(zhǎng)因子；HAPO還可以拮抗人巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞

2、系MO7e去除因子誘發(fā)的凋亡；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)HAPO有放射保護(hù)作用，能明顯提高經(jīng)同位素亞致死量照射小鼠存活率，加速其造血功能的恢復(fù)。為了能更加深入的了解HAPO的生物學(xué)功能，我們以HUVEC為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究了HAPO促進(jìn)細(xì)胞增殖所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：在本實(shí)驗(yàn)里，我們用MTT和BrdU摻入的方法檢測(cè)了HAPO對(duì)于HUVEC增殖能力的影響，并用流氏檢測(cè)了HUVEC細(xì)胞周期的分布。我們用Western blot的方法檢測(cè)了HAP

3、O對(duì)于HUVEC內(nèi)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)常用阻斷方法來(lái)進(jìn)行分析。激酶抑制劑是一種小分子化合物，近年來(lái)出現(xiàn)的一些高特異性蛋白激酶抑制物能夠?qū)Ｒ桓咝У匾种铺囟ǖ鞍准っ傅墓δ?。目前，在?guó)內(nèi)外研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的文獻(xiàn)中，幾乎絕大部分都采用了激酶抑制劑作為阻斷分析研究的首選。該方法特異，簡(jiǎn)單，易于量化，重復(fù)性好，且對(duì)細(xì)胞影響較少。此外，我們對(duì)HAPO與其他作用比較明顯的內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子的協(xié)同作用進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果：HAPO能增

4、加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，并呈劑量依賴性。500 ng/ml HAPO的效果最為明顯，可以達(dá)到130±5％(MTT)和142±6％(BrdU)。通過(guò)Westernblot分析，我們發(fā)現(xiàn)HAPO在HUVEC中激活了PI3-K/Akt信號(hào)通路，50μM的LY294002可以完全抑制HAPO造成的Akt的磷酸化。我們用抑制劑阻斷的方法證明了HAPO是通過(guò)激活PI3-K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)HUVEC增殖的。進(jìn)一步的檢測(cè)與分析發(fā)現(xiàn)HAPO可以明顯的