鹽對內(nèi)皮細胞腎上腺髓質(zhì)素分泌和表達的影響及機制的研究.pdf

1、目的:(1)研究高鹽對 HUVECs增殖活性的影響。(2)研究高鹽對HUVECs ADM、ADMR mRNA表達的影響,探討其可能的信號通路。(3)研究高鹽對HVECs凋亡的影響及可能機制。
　　方法:1.用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs,選3-9代對數(shù)生長期的細胞進行實驗。2.用不同濃度 NaCl(對照組、137mmol/L、142mmol/L、147mmol/L、152mmol/L、157mmol/L

2、)干預HVECs24h后,用CCK-8試劑盒檢測鹽對HUVECs增殖活性的影響。3.將實驗分兩部分進行,實驗1:實驗共分六組,分別為對照組:正常培養(yǎng)HUVECs未加入任何藥物;137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組分別為:培養(yǎng)24小時后加入不同濃度NaCl,使終濃度分別為137mmol/L、142mmol/L、147mmol/L、152mmol/L、157mmol/L

3、,繼續(xù)作用24小時后,用RT-PCR檢測細胞中ADM及ADMR mRNA的表達;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測細胞培養(yǎng)液中ADM及ADMR濃度;用AnnexinV-FTTC/PI染色流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗2:通過實驗1選出最佳鹽濃度為152mmol/L,繼續(xù)進行實驗。實驗分六組如下:152 mmol/l組:培養(yǎng)48小時后加入NaCl,終濃度為152mmol/L,繼續(xù)作用24小時。PD98059(ERK抑制劑)組、SP6001

4、25(JNK抑制劑)組、SB203508(P38抑制劑)組、Staurosporine( PKC抑制劑)組、LY-294002(PI3K抑制劑)組:培養(yǎng)24小時后,先分別用PD98059、SP600125、SB203508、Staurosporine、LY-294002作用細胞24h再加入 NaCl(終濃度為152mmol/L),繼續(xù)作用24小時。(其中除Staurosporine為10nmol/L外,其余均為10umol/L),并以與

5、實驗1相同方法檢測ADM的濃度, ADM及ADMR mRNA的表達及細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:1、對照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組細胞增殖活力分別為(0.998±0.197)、(0.952±0.091)、(0.946±0.076)、(0.811±0.145)、(0.802±0.116)、(0.659±0.15)。137mmol/L組、142mmo

6、l/L組、147mmol/L組、152mmol/L組與對照組比較(P>0.05),157 mmol/L組與對照組比較(P<0.05)。2、RT-PCR檢測內(nèi)皮細胞中ADM及ADMR mRNA的表達結(jié)果顯示:對照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組ADM mRNA的IODADM/IODGAPDH分別為0.03±0.01、0.10±0.01、0.20±0.01、0.

7、21±0.02、0.43±0.02、0.40±0.04,各組與對照組相比(P<0.05);對照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組 ADMR mRNA的IODADMR/IODGAPDH分別為0.07±0.02、0.12±0.02、0.13±0.02、0.16±0.02、0.28±0.03、0.17±0.02,各組與對照組相比P均小于0.05;152mmol/L組

8、、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurospo rine組、LY-294002組ADM mRNA的IODADM/IODGAPDH分別為0.10±0.01、0.15±0.02、0.29±0.04、0.31±0.02、0.17±0.02、0.15±0.01, SP600125組、SB203508組與152mmol/L組相比(P<0.05),PD98059組、Staurosporine組、LY-294002組與

9、152mmol/L組相比(P>0.05);152mmol/L組、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurosporine組、LY-294002組ADMR mRNA的IODADMR/IODGAPDH分別為0.08±0.01、0.20±0.01、0.22±0.03、0.23±0.02、0.09±0.01、0.09±0.02,PD98059組、SP600125組、SB203508組與152mmol/L組相比(P<0

10、.05),Staurosporine組、LY-294002組與152mmol/L組相比(P>0.05)。3、ELISA法檢測ADM結(jié)果顯示:對照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組ADM的濃度(pg/ml)分別為20.13±0.15、34.91±0.59、41.15±0.79、41.30±1.13、43.16±1.04、34.68±0.27,各組與對照組比較(P

11、<0.05),152mmol/L組與157mmol/L組相比(P<0.05)。152mmol/L組、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurosporine組、LY-294002組ADM的濃度(pg/ml)分別為43.16±1.04、51.50±8.28、72.23±2.23、75.33±2.93、44.95±3.33、36.33±3.78,SP600125組、SB203508組與152mmol/L組比較(P

12、<0.05),PD98059組、Staurosporine組、LY-294002組與152mmol/L組比較(P>0.05)。4、AnnexinV-FTTC/PI染色流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示:對照組、152 mmol/L組、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurosporine組、LY-294002組凋亡率分別為2.3±0.73％、30.07±2.13％、14.35±1.56％、13.47±0.99

13、％、10.19±1.12％、35.7±2.01％、59.8±3.19％,各組與對照組相比(P<0.05),PD98059組、SP600125組、SB203508組、LY-294002組與152 mmol/L組相比(P<0.05),Staurosporine組與152 mmol/L組相比(P>0.05)。
　　結(jié)論:1、高鹽抑制內(nèi)皮細胞增殖。2、高鹽通過MAPK通路抑制內(nèi)皮細胞ADM、ADMR mRNA的表達。3、高鹽能誘導內(nèi)皮細胞