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文檔簡(jiǎn)介
1、背景: 心血管疾病已成為危害人類健康的第一殺手,動(dòng)脈粥樣硬化是心血管事件發(fā)病的共同基礎(chǔ)。甲狀腺功能異??芍苯踊蜷g接導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理生理改變。血管內(nèi)皮完整性及內(nèi)分泌功能是維持血管內(nèi)皮功能正常的重要基礎(chǔ),因此血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要機(jī)制。甲狀腺功能異?;颊吆喜⒀軆?nèi)皮功能障礙,是其高于同性別、同年齡正常人群的心血管事件發(fā)生率的重要原因,而早期血管內(nèi)皮功能障礙是可以逆轉(zhuǎn)
2、的,因此早期診斷、早期治療甲狀腺疾病患者血管內(nèi)皮功能障礙顯得十分重要。然而,在甲狀腺功能異常狀態(tài)下動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,尤其是血管內(nèi)皮功能受損的機(jī)制目前仍然不清楚。
護(hù)骨素(OPG)是一種分泌型糖蛋白,可抑制破骨細(xì)胞分化和功能,增高骨密度。近來(lái)發(fā)現(xiàn)它是一種重要的血管調(diào)節(jié)因子。甲狀腺功能異常患者往往伴血清OPG水平升高,但是OPG在甲狀腺功能異常狀態(tài)下對(duì)血管內(nèi)皮功能的具體的作用及機(jī)制目前尚不清楚。
核因子κ B是
3、重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,廣泛參與許多病理生理反應(yīng)。IκB激酶(IKK)是核因子KB激活的關(guān)建酶。IKK由3個(gè)亞基組成,IKKα、IKKβ和IKKγ,而IKK活性主要表現(xiàn)為IKKβ。IKKβ能抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)重要的上游蛋白TSC1活性。mTOR作為很多信號(hào)通路的下游,在調(diào)節(jié)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和能量代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡中發(fā)揮重要作用,mTOR主要通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體S6蛋白激酶(S6K)和真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4EB
4、P1)活性來(lái)發(fā)揮作用,而OPG對(duì)甲狀腺功能異常狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及核因子κB,mTOR作用及機(jī)制目前缺乏相關(guān)研究證據(jù)。
為此,本課題假設(shè):甲狀腺功能異常狀態(tài)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,OPG通過(guò)抑制IKKβ/mTOR信號(hào)通路,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。
目的:本研究通過(guò)不同濃度甲狀腺激素干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,探討OPG對(duì)不同甲狀腺功能狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制,旨在為OPG在未來(lái)治療及預(yù)防甲狀
5、腺功能異?;颊哐懿∽兗皠?dòng)脈粥樣硬化等方面的應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1.細(xì)胞培養(yǎng):入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株用含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)在37℃、5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。
2.MTT試驗(yàn):MTT法檢測(cè)不同濃度甲狀腺激素(0、0.1、1、10、50、100nmol/L,T3)在不同時(shí)間(24h、48h、72h)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性影響,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)探討最佳
6、時(shí)間點(diǎn)。
3.細(xì)胞凋亡檢測(cè):Hoechst33258與流式細(xì)胞檢測(cè)不同濃度甲狀腺激素下(0、0.1、1、10、50、100nmol/L,T3)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)探討最佳低濃度與高濃度甲狀腺激素。
4.實(shí)驗(yàn)分組:將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分組:對(duì)照組(0nmol/L,T3)、對(duì)照組(0nmol/L,T3)+OPG(100ng/ml)、低濃度組(0.1nmol/L,T3)、低濃度組(0.
7、1nmol/L,T3)+OPG(100ng/ml)、生理濃度組(1nmol/L,T3)、生理濃度組(1nmol/L,T3)+OPG(100ng/ml)、高濃度組(10nmol/L,T3)、高濃度組(10nmol/L,T3)+OPG(100ng/ml)下培養(yǎng)48h。Hoechst33258和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
5.Western blot分析各組細(xì)胞磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶β(p-IKKβ)、NF-κ B抑制蛋
8、白激酶β(IKKβ)、磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(p-TSC1)、結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(TSC1)、磷酸化核糖體蛋白S6激酶(p-S6K)、核糖體蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)、Bcl-2及Bax表達(dá)水平。
6.統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,MTT數(shù)值采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。Hoechst33258染色與流式細(xì)胞術(shù)
9、檢測(cè)結(jié)果比較采用單變量方差分析(One-Way ANOVA),SNK法;干預(yù)組與未干預(yù)組比較用兩個(gè)樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.細(xì)胞形態(tài):倒置相差顯微鏡下,可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁,伸出偽足;細(xì)胞完全貼壁時(shí),呈圓形、短梭形或扁平多角形,且單層排列;3~4d呈魚貫狀相連;5~6d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,達(dá)到其生長(zhǎng)高峰,處于生長(zhǎng)平臺(tái)期。
2.細(xì)胞生長(zhǎng)活性(MTT):不同濃度組間有顯著差異(F
10、=299.27,P=0.000),其中生理濃度(1nmol/L)下細(xì)胞活性均高于其他濃度;不同時(shí)間組之間有顯著差異(F=1237.19,P=0.000),生理濃度(1 nmol/L T3)在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HUVEC保護(hù)作用最佳。細(xì)胞生長(zhǎng)活性隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而減弱,選取48h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。
3.細(xì)胞凋亡檢測(cè):(1) Hoechst33258染色:生理濃度(1nmol/L)時(shí),細(xì)胞凋亡率(13.67%±1.85%)最低
11、,各組細(xì)胞凋亡率為48.22%±1.06%(0nmol/L,T3),34.13%±0.85%(0.1 nmol/L,T3),31.32%±2.51%(10 nmol/L,T3),62.74%±3.40%(50 nmol/L,T3),82.47%±6.37%(100 nmol/L,T3),各組與生理濃度組相比,細(xì)胞凋亡率差異均具有顯著性意義(P<0.05)。(2) Annexin V-FITC/PI雙染法:0、0.1、10nmol/L組與
12、生理濃度組早期凋亡率分別為28.24%±7.57%,29.92%±6.07%,26.13%±2.28%,8.57%±154%;而總凋亡率為44.90%±6.34%,38.95%±7.78%,31.86%±1.06%,13.52%±1.66%,0、0.1、10nmol/L組與生理濃度組相比,早期凋亡率和總凋亡率差異具有顯著性意義(P<0.05);而50、100nmol/L組和生理濃度組中晚期凋亡率為59.19%±5.86%,75.45%±
13、7.39%,4.95%±1.26%,總凋亡率為67.04%±5.93%,84.66%±6.40%,13.52%±1.66%,而50、100nmol/L組與生理濃度相比,中晚期凋亡率和總凋亡率差異具有顯著性意義(P<0.05)。(3) Hoechst33258染色觀察OPG對(duì)不同濃度甲狀腺激素下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化:對(duì)照組,低濃度組,生理濃度組,高濃度組細(xì)胞凋亡率分另為49.27%±4.80%,36.11%±2.57%,18.
14、43%±4.91%,35.91%±1.86%,OPG干預(yù)后,各組細(xì)胞凋亡率分別為24.47%±2.16%,15.97%±0.87%,16.16%±2.33%,24.05%±3.04%,對(duì)照組、低濃度組、高濃度組細(xì)胞干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率具有明顯差異,P值分別為0.044,0.040,0.043;生理濃度組OPG干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異(P=0.59)。(4) Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)OPG對(duì)不同濃度甲狀腺激素下人臍靜
15、脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:對(duì)照組,低濃度組,高濃度組早期凋亡率分別為35.33%±2.51%,28.63%±0.68%,27.09%±3.29%,OPG干預(yù)后,各組早期凋亡率分別為19.51%±1.33%,11.05%±4.00%,18.40%±7.67%,各組OPG干預(yù)前后早期凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.035,0.048,0.019;對(duì)照組,低濃度組,高濃度組總凋亡率分別為47.97%±5.11%,39.79%±0.88%,
16、35.14%±2.58%;OPG干預(yù)后,各組總凋亡率分別為30.68%±1.97%,19.30%±3.63%,24.64%±8.78%,各組OPG干預(yù)前后總凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.048,0.028,0.045。生理濃度組早期細(xì)胞凋亡率和總凋亡率分別為12.80%±2.62%,16.55%±2.36%,經(jīng)OPG干預(yù)后,分別為11.98%±2.71%和17.97%±1.55%,干預(yù)前后早期細(xì)胞凋亡率和總凋亡率無(wú)明顯差異,P
17、值分別為0.885,0.206。
4.IKKβ/mTOR通路:與生理濃度組相比,對(duì)照組、低濃度組和高濃度組p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、Bax表達(dá)顯著增高(均p<0.05),p-AKT、Bcl-2表達(dá)顯著降低(均p<0.05);經(jīng)OPG干預(yù)后,對(duì)照組、低濃度組、高濃度組p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、Bax分別低于以上未干預(yù)組(均p<0.05),而p-AKT、Bcl-2表達(dá)高于未干預(yù)組(均p<0.05);
18、生理濃度組OPG干預(yù)前后p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、p-AKT、Bcl-2、Bax表達(dá)無(wú)明顯差異(均P>0.05);低濃度組與高濃度組經(jīng)rapamycin或BMS345541干預(yù)后,p-AKT、Bcl-2表達(dá)增高(均P<0.05),Bax表達(dá)降低(P<0.05)。
結(jié)論:
1.生理濃度甲狀腺激素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用最大。
2.OPG對(duì)低、高濃度甲狀腺激素下人臍靜脈上皮細(xì)胞具有保
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