腎上腺髓質(zhì)素和內(nèi)皮素在糖尿病大鼠腎組織的表達.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是一種慢性腎臟病變。隨著人民生活水平的提高和人口的老齡化，糖尿病(Diabetesmellitus，DM)發(fā)病率逐年上升，糖尿病腎病是糖尿病的最常見的并發(fā)癥，糖尿病患者一旦發(fā)生蛋白尿則病情不可逆轉(zhuǎn)，往往發(fā)展至終末期腎功能衰竭。因此，探討糖尿病腎病的發(fā)病機制，尋求有效的防治措施，預(yù)防其發(fā)生、延緩其進展，具有重大意義。 腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM

2、)是日本學(xué)者Kitamura等[1]于1993年從人的腎上腺嗜鉻細胞瘤中分離純化出的一種由52個氨基酸組成的多肽。其生物學(xué)效應(yīng)廣泛，有明顯的舒張血管、降低血壓、抑制細胞生長、增殖等功能，在腎臟功能調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。內(nèi)皮素(Endothelin，ET)是一種由21個氨基酸組成的多肽，具有強烈收縮血管和促進細胞生長增殖作用，其中最重要的是ET-1。ET-1對糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用。已有資料表明，腎小球高濾過和高灌注是DN的

3、始動因素，能誘發(fā)糖尿病性腎小球硬化，血管活性物質(zhì)在其中發(fā)揮著重要作用，ADM和ET-1都是重要的血管活性物質(zhì)。但有關(guān)ADM和ET-1在DN發(fā)病過程中的動態(tài)變化卻鮮見報道。本研究應(yīng)用糖尿病大鼠模型，采用多種實驗技術(shù)從蛋白和mRNA水平，檢測DN時ADM、ET-1及受體表達情況，以及在DN發(fā)病過程中的動態(tài)變化并探求其機制。 方法：用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘發(fā)單側(cè)腎切除大鼠實驗性糖尿病模型。健康雄性Wist

4、ar大鼠右側(cè)腎切除兩周后，隨機分為右腎切除對照組(A組)和糖尿病組(B組)，每組24只。B組大鼠腹腔單次注射STZ(STZ65mg/kgWT，用pH4.5，0.1mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配制)，A組只注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液。48～72h后，血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++的大鼠確定為糖尿病模型。分別在注射STZ后第1周、2周、4周和6周各取動物6只，代謝籠留取24h尿，股動脈取血分離血清，測定腎功能。切取腎臟進行以

5、下觀察：①石蠟包埋行HE和PAS染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎小球系膜基質(zhì)、腎小球及腎小管基底膜增厚情況等病理改變。②免疫組織化學(xué)方法檢測腎組織中腎上腺髓質(zhì)素、腎上腺髓質(zhì)素受體(Adrenomedullinreceptor,ADMR)、內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素受體A(EndothelinreceptortypeA，EDNR-A)蛋白水平的表達。③Western印跡檢測腎皮質(zhì)組織中ADMR和EDNR-A蛋白水平的表達。④原位雜交方法檢測腎組織中ADM在

6、mRNA水平上的表達。⑤逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetransecriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測腎皮質(zhì)組織中ET-1mRNA的表達。⑥統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用-x±s表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件完成。 結(jié)果1.體重、腎重和腎重/體重比的變化：B組大鼠在2周時體重己明顯減輕，腎重和腎重/體重比較A組明顯增加(P＜0.01)。

7、 2.腎功能測定：B組與A組相比血糖、BUN和尿蛋白增高(P＜0.01)，Ccr則B組與A組相比顯著降低(P＜0.01)。 3.光鏡下觀察：B組與A組相比，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多。 4.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果：①ADM的表達：A組腎小管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞胞漿中均呈陽性表達；B組各期表達均顯著高于A組，且在1周、2周、4周表達有逐漸增加趨勢，在4周表達最顯著，6周時表達較4周減弱。②ADMR的表達：A組ADMR陽性

8、顆粒見于腎小管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)；B組表達明顯增強，且從1周、2周、4周至6周，表達依次增強。③ET-1的表達：A組腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞及血管平滑肌細胞胞漿內(nèi)均有陽性表達；B組1周時表達弱于A組，2周、4周、6周表達顯著強于A組且有逐漸增加趨勢。④EDNR-A的表達：A組在腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞及血管平滑肌細胞胞漿內(nèi)均有陽性表達；B組表達明顯增強，且從1周、2周、4周至6周表達依次增強。

9、 5.Western印跡結(jié)果：①ADMR的表達：A組ADMR(分子量42kDa)的表達較弱，B組表達較A組增高，呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，6周表達最顯著；ADMR二聚體(分子量86kDa)也有相同的變化趨勢(P＜0.01)。②EDNR-A(分子量45kDa)的表達：B組較A組表達明顯增強，且從1周、2周、4周至6周表達依次增強(P＜0.01)。 6.原位雜交檢測ADMmRNA的表達：ADMmRNA陽性顆粒在腎小管上皮細胞和血管內(nèi)

10、皮細胞胞漿中表達。A組ADMmRNA表達較弱，B組各期表達較A組均明顯增高，且在1周、2周、4周表達有逐漸增加趨勢，4周表達最顯著，6周時表達弱于4周。 7.RT-PCR檢測腎皮質(zhì)ET-1mRNA的表達：B組1周時表達弱于A組，2周、4周、6周表達顯著強于A組且有逐漸增加趨勢(P＜0.01)。 結(jié)論1.在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中，腎組織ADM及其受體出現(xiàn)一過性過度表達，且在mRNA和蛋白水平表達一致，其意義有待進一步研究