AMPK調節(jié)內皮細胞氧化膽固醇外流及其機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)早期特征性病理改變是血管內皮功能紊亂,主要表現為血管內皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性下降,引起一氧化氮(Nitric oxide,NO)生成減少,造成內皮依賴性血管舒張功能障礙[1-4],研究表明,高膽固醇膳食可抑制內皮依賴性血管舒張,進而導致內皮功能紊亂,而血漿低密度脂蛋白(low density lipoprot

2、eins,LDL)濃度的升高及氧化增加是其導致AS的關鍵環(huán)節(jié)[5-7]。氧化型膽固醇(oxysterols),是膽固醇經氧化后產生的一類化合物,研究發(fā)現7-酮膽醇(7-ketocholesterol,7-KC)在血液循環(huán)中含量很低,但在AS斑塊內含量極高,并與AS病理損傷密切相關[8-9]。
　　 AMP激活性蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是

3、機體內參與能量代謝重要的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶,主要分布于肝臟、心臟及骨骼肌中,在細胞內以異三聚體形式存在,由一個α催化亞單位,兩個調節(jié)亞單位β和γ組成[10]。AMPK激活抑制機體內合成代謝反應,如蛋白質、脂肪酸、膽固醇合成等；但卻促進體內分解代謝,增加ATP的生成[11]。最近研究發(fā)現,AMPK同樣存在于血管內皮細胞中,并參與eNOS活性穩(wěn)態(tài)的調節(jié)及NO的生物合成,與內皮細胞的功能密切相關[12,13]。但迄今為止,有關AMPK激活

4、對高膽固醇誘導內皮細胞功能紊亂的影響及其機制未見任何報道。
　　 三磷酸腺苷結合盒轉運體家族(ATP-binding cassette transporter,ABC)的ABCA1和ABCG1被認為是細胞膽固醇跨膜運輸的兩個關鍵轉運子[14-16]。在轉錄水平兩者均受肝臟核受體(liverⅩ receptorα,LⅩRα)的調控[17]。在轉運膽固醇方面,兩者有不同之處,ABCA1主要是促進游離膽固醇流向不含脂的受體,如apoA

5、I或ApoE,而ABCG1更傾向于促進膽固醇和膽固醇酯流向高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)[17-19],因此轉運能力明顯強于ABCA1。此外,ABCG1能夠通過HDL介導促進巨噬細胞氧化膽固醇特別是7-KC的流出[20]。這也是目前ABC家族中唯一被發(fā)現具有調節(jié)氧化膽固醇轉運作用的分子。鑒于ABCG1在細胞膽固醇轉運中的重要作用,以往大量的研究主要關注他在調節(jié)巨噬細胞膽固醇平衡,抑制巨噬泡沫細胞

6、形成中的作用。近年來有研究發(fā)現,血管內皮細胞中也存在ABCG1表達[21],并可通過調節(jié)氧化膽固醇轉運來維持血管內皮正常生理功能。因此如果能夠上調血管內皮ABCG1表達將有利于保護血管功能,從而逆轉高膽固醇所致血管內皮功能障礙,這也為AS的早期防治帶來了新的契機和研究切入點。
　　 研究假設:
　　 AMPK可能通過促進血管內皮細胞ABCG1表達,介導膽固醇外流,緩解高膽固醇誘導的內皮細胞ROS生成及eNOS活性抑制。<

7、br>　　 實驗方法
　　 1、AMPK活化對HAECs內ABCG1表達的影響
　　 為確定AMPK活化對ABCG1表達的影響,人體主動脈內皮細胞(Humanaortic endothelial cells,HAECs)暴露于不同濃度AMPK(0-2mmol/L)激動劑AICAR于不同時間段(0-24h)后,分別采用Northern blot、real time RT-PCR、Western blot檢測ABCG1的表

8、達。
　　 由于AICAR是AMPK的非特異性激動劑,我們進一步觀察了另外兩種AMPK激動劑——二甲雙胍(metformin)和A-769662對ABCG1表達的影響。將HAECs分別與二甲雙胍(1 mM)和A-769662(100μM)培養(yǎng)8 h,提取總RNA和蛋白,用real time RT-PCR和Western blot方法檢測ABCG1 mRNA和蛋白表達。
　　 2、AMPK活化影響HAECs內ABCG1 m

9、RNA表達的機制
　　 研究表明,LⅩRα在ABCG1的上游,LⅩRα的轉錄活性增加會促進ABCG1的表達。為闡明AICAR誘導ABCG1表達是否依賴于LⅩRα介導作用,我們采用螢光素酶報道基因技術分析了LⅩRα反應元件在此過程的作用。
　　 由于螢光素酶報道基因實驗的陰性結果否定了AICAR誘導ABCG1表達過程中LⅩRα的特異性介導作用,我們推測AICAR對ABCG1 mRNA表達的誘導可能是通過轉錄后的調節(jié)機制。故

10、我們進一步測定了AICAR作用后細胞中ABCG1 mRNA T1/2的變化。HAECs經溶劑對照或1mmol/LAICAR處理24h后,加入放線菌素D處理不同時間以終止轉錄。然后采用Northern Blot分析ABCG1mRNA的表達,并將放線菌素D處理后各時間點ABCG1 mRNA剩余百分數的對數與時間作圖,并通過軟件計算ABCG1 mRNA T1/2.
　　 3、AMPK活化對HAECs內膽固醇及7-KC外流的影響

11、　　 將HAECs單獨以膽固醇(10μg/mL)或7-KC(10μg/mL)處理,或與AICAR(0.25～2.0 mM)共同培養(yǎng)24h,PBS清洗后再與20μg/mL HDL孵育16h,然后收集細胞和培養(yǎng)液,加入膽固醇分析液后,采用熒光分光光度計檢測細胞、培養(yǎng)液中膽固醇或氧化膽固醇(7-KC)的含量。
　　 為證實在此過程中AMPK、ABCG1的特異性介導作用,我們分別采用AMPK抑制劑compound C及ABCG1 si

12、RNA預處理,然后觀察對AICAR誘導HAECs膽固醇、7-KC外流的影響。
　　 4、AMPK活化對HAECs內氧化應激、eNOS活性的影響
　　 通過采用carboxy-H2DCFDA(Invitrogen)檢測HAECs內ROS水平,GSH/GSSG ratio assay kit(Caibiochem)檢測GSH/GSSG比值,NOS Assay Kit(Calbiochem)檢測eNOS活性,cyclic GM

13、P ELA KIT(Cayman chemical)檢測cGMP水平,并結合ABCG1 SiRNA技術,我們觀察了1mmol/L AICAR同處理24h對7-KC(10μg/mL)誘導HAECs氧化應激、eNOS活性抑制及NO生成減少的影響,并特異性評價ABCG1在此過程中的特異性介導作用。
　　 結論
　　 1.AMPK活化通過增NABCG1 mRNA的穩(wěn)定性特異性上調體外培養(yǎng)的內皮細胞ABCG1 mRNA和蛋白的表達