二苯乙烯苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞膽固醇外流的影響.pdf

1、目的：
　　何首烏的主要化學(xué)成分有總苷、多糖及蒽醌類化合物等，其中以總苷類成分中的二苯乙烯苷最為多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察二苯乙烯苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞膽固醇含量的變化，以及細(xì)胞內(nèi)膽固醇相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)情況，闡明該化合物降低膽固醇水平的作用是通過(guò)加快膽固醇外流而發(fā)揮作用的，從而初步探討二苯乙烯苷抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，為何首烏抗高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的研究提供依據(jù)。
　　方法：

2、r>　　1.肝癌HepG2細(xì)胞采用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清、1％雙抗及高糖型DMEM。靜置于37℃，5％CO2飽和濕度條件下孵育箱中培養(yǎng);
　　2.制作高膽固醇細(xì)胞模型，采用不同濃度的ox-LDL(0mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L)處理細(xì)胞不同時(shí)間(24h、48h、72h)對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響，通過(guò)膽固醇氧化酶法測(cè)定膽固醇含量及油紅O染色觀察，優(yōu)選最佳藥物濃度及作用時(shí)間;
　　3.

3、MTT法檢測(cè)不同濃度二苯乙烯苷(0、62.5、125、188、250、500、600、700、800、900、1000μmol/L)作用不同時(shí)間(24h、48h)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響，確定體外細(xì)胞給藥濃度水平及作用時(shí)間，以闡明二苯乙烯苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞膽固醇外流的影響;
　　4.二苯乙烯苷在高膽固醇狀態(tài)下對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的影響，用不同濃度二苯乙烯苷（0、62.5、125、188、250μmol/L

4、）處理細(xì)胞48h后，通過(guò)膽固醇氧化酶法測(cè)定上清、裂解細(xì)胞膽固醇含量，檢測(cè)二苯乙烯苷是否能夠通過(guò)加快細(xì)胞膽固醇外流這一途徑來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量;
　　5.RT-PCR法檢測(cè)二苯乙烯苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ATP-binding cassette transporterG1，ABCG1）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)以及B族Ⅰ型清

5、道夫受體（scavenger reptor class BtypeⅠ，SR-BⅠ）基因相對(duì)表達(dá)量的影響;
　　6.蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)二苯乙烯苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1)蛋白表達(dá)量的影響。
　　結(jié)果：
　　1.制作高膽固醇模型，經(jīng)油紅O染色后，細(xì)胞體積增大變圓，胞漿內(nèi)有許多的脂滴存在，胞漿疏松化;膽

6、固醇氧化酶法測(cè)定結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol，TC)和游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)含量均明顯增加(P＜0.05)，同時(shí)，可以看出ox-LDL在50mg/L作用細(xì)胞48h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量最高，與油紅O結(jié)果一致。可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.MTT結(jié)果顯示二苯乙烯苷在62.5μmol/L～250μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞均未產(chǎn)生顯著影響，表

7、明其對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，藥物作用48h時(shí)效果最好，可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用。
　　3.在高膽固醇狀態(tài)下，加用不同濃度二苯乙烯苷(0、62.5、125、188、250μmol/L)干預(yù)細(xì)胞48h后，研究顯示，與模型組相比，藥物組裂解細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);同時(shí)藥物組上清TC、FC含量顯著升高(P＜0.05)。二苯乙烯苷能夠明顯減少高膽固醇細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，增加膽固醇外排率，其中二苯乙烯苷濃度為

8、125μmol/L時(shí)達(dá)到最高值，表明二苯乙烯苷對(duì)HepG2高膽固醇細(xì)胞有明顯抑制作用。
　　4.RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的二苯乙烯苷作用細(xì)胞48h后，與模型組相比，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)及清道夫受體(SR-BⅠ)的基因表達(dá)有明顯升高趨勢(shì)，其中ABCG1和ABCA1在二苯乙烯苷濃度為250μmol/L時(shí)達(dá)到最高值;SR-BⅠ在二苯乙烯苷濃度為188μmol/L時(shí)達(dá)到最高值，差

9、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度的二苯乙烯苷作用細(xì)胞48h后，與模型組相比，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1）蛋白表達(dá)有明顯升高趨勢(shì)，其中二苯乙烯苷濃度在188μmol/L時(shí)達(dá)到最高值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　二苯乙烯苷能夠促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞膽固醇的外流，其機(jī)制