Nur77調(diào)控HepG2細(xì)胞膽固醇代謝平衡的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 目前，由于飲食結(jié)構(gòu)不合理以及缺乏足量的運(yùn)動，膽固醇代謝紊亂的患者越來越普遍。而膽固醇代謝紊亂是公認(rèn)的動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素之一，與急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)及腦卒中(Strock)等嚴(yán)重危害生命的疾病密切相關(guān)。肝臟作為人體最重要的代謝器官在膽固醇代謝方面也起著非常重要的作用，在各種肝臟疾病的患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)膽固醇代謝紊亂的情況。因此，當(dāng)研究膽固醇代謝紊亂時

2、，經(jīng)常會考慮到肝細(xì)胞在其中的作用。
　　 Nur77(Nuclear Receptor Subfamily 4Group A Member1,NR4A1)又稱神經(jīng)生長因子IB(Nerve Growth Factor I-B，NGFI-B)，是1988年Milbrandt等用神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12后發(fā)現(xiàn)的一種新基因。它與Nurrl(NR4A2)和Norl(NR4A3)同屬于NR4A孤兒核受體超家族，擁有經(jīng)典的

3、N端功能激活結(jié)構(gòu)域、中間的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及C端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。但是其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是非典型的，缺乏經(jīng)典的核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的配體接受袋和共激活位點(diǎn)。因此，他們沒有特定的配體，其功能的調(diào)節(jié)不像普通核受體那樣通過與配體結(jié)合，而是通過自身的表達(dá)以及翻譯后的修飾。Nur77是一種快速反應(yīng)基因，在生長因子、炎癥等刺激下可以快速誘導(dǎo)表達(dá)。目前的研究證實(shí)，Nur77參與到很多生物學(xué)過程的調(diào)控，包括細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、糖代謝以及骨骼肌細(xì)胞能量

4、供應(yīng)等生理與病理生理過程。在Nur77與肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)系方面，已有的研究證實(shí)，Nur77參與小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)控，可以通過抑制SREBP1c的活性降低肝細(xì)胞甘油三酯的水平。然而，還沒有明確的證據(jù)證實(shí)Nur77是否可以參與調(diào)控肝細(xì)胞對膽固醇的調(diào)控，特別是在人源性的肝細(xì)胞中更加不清楚。
　　 方法:
　　 1、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化與Nur77 RNA干擾條件的摸索
　　 在10％、15％、20％不同血清濃度下

5、將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72 h后對細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量進(jìn)行比較，從而確定最佳的培養(yǎng)基血清含量。在相同初始細(xì)胞密度與培養(yǎng)條件下將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至生長匯合度為20％、50％、80％、90％、100％及匯合度為100％后再培養(yǎng)12h、24 h，對不同匯合度時活細(xì)胞、死細(xì)胞數(shù)量及其比值分別進(jìn)行比較，從而確定最佳的傳代時機(jī)。對于相同生長條件的HepG2細(xì)胞，用PBS洗滌0、1、2、3、4、5次以后，對胰酶消化時間進(jìn)行比較，從而

6、確定最佳的傳代條件。
　　 對于化學(xué)合成的三對siRNA片段，均選取50nM的終濃度對相同生長狀況的HepG2細(xì)胞干擾24h，然后通過RT-PCR對Nur77的干擾效率進(jìn)行比較，從而篩選出最佳的siRNA片段。選取以上干擾效果最好的siRNA片段，以50nM的終濃度對相同生長狀況的HepG2細(xì)胞分別干擾24h、36h、48h，通過RT-PCR對Nur77的干擾效率進(jìn)行比較，從而確定最佳的干擾時間。然后選取上述干擾效果最好的siR

7、NA片段與干擾時間，分別以50nM、100nM的終濃度對相同生長狀況的HepG2細(xì)胞實(shí)施干擾，通過RT-PCR對Nur77的干擾效率進(jìn)行比較，從而確定最佳的干擾濃度。
　　 2、Nur77過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染與過表達(dá)效果鑒定
　　 分別以PCR-XL-TOPO載體和PIRES2-EGFP載體為模版對Nur77和EGFP片段進(jìn)行擴(kuò)增，在Nur77上游添加EcoRI酶切位點(diǎn)擴(kuò)增得到EcoRI-Nur77片段，在EGFP

8、下游添加XhoI酶切位點(diǎn)，在上游添加IRES連接基因，擴(kuò)增得到IRES-EGFP-XhoI。然后通過重疊PCR將上述兩個片段進(jìn)行連接，合成含有目的基因Nur77和EGFP的片段EcoRI-Nur77-IRES-EGFP-XhoI。通過雙酶切將上述片段連入pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建成重組過表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1-Nur77。使用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-Nur77轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，并通過RT-P

9、CR與Western Blotting分別在mRNA水平和蛋白水平鑒定過表達(dá)效果。
　　 3、Nur77對HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平及其代謝調(diào)控相關(guān)基因的影響
　　 實(shí)驗(yàn)分為五組，空白組(Blank)、RNA干擾對照組(siRNA-NC)、RNA干擾組（siRNA-Nur77）、過表達(dá)對照組(pcDNA3.1-monk)、過表達(dá)組(pcDNA3.1-Nur77)。在siRNA或過表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后6h進(jìn)行換液時加入0.5

10、nM的油酸、亞麻酸（2:1比例）混合物對HepG2細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)過載培養(yǎng)。48h后對各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，比較各組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(Total Cholesterol，TCHO)水平。相同條件下使用油紅O染色對各組細(xì)胞的脂質(zhì)水平進(jìn)行鑒定。對于五組細(xì)胞，相同處理因素非脂質(zhì)過載培養(yǎng)48h后對肝細(xì)胞膽固醇代謝調(diào)控的三個關(guān)鍵基因的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行比較。三個關(guān)鍵基因分別為∶低密度脂蛋白受體（Low Density Lipoprotein

11、Receptor，LDLR）、HMGCoA還原酶(HMGCoA Reductase，HMGCR)以及肝x受體α(Liver x Receptorα，LxRα)。
　　 4、Nur77激動劑CsnB對HepG2細(xì)胞膽固醇代謝調(diào)控基因的影響
　　 用含有10μg/mLCsnB濃度的培養(yǎng)基對HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，0h、0.75h、1.5h、3h、6h、12h以及24h后分別提取總RNA，用RT-PCR檢測Nur77以及LDL

12、R、HMGCR、LXRα的mRNA相對表達(dá)量。對照組用CsnB溶劑DMSO代替CsnB，其他條件相同。對實(shí)驗(yàn)組與對照組不同處理時間各基因的變化與差別進(jìn)行分析。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以(x)+s表示。方差齊性檢驗(yàn)采用Levene's test。各培養(yǎng)時間點(diǎn)各血清濃度細(xì)胞數(shù)量的比較采用析因設(shè)計資料的方差分析（General Linear Model-Un

13、ivariate），組間多重比較采用LSD法;不同匯合度細(xì)胞數(shù)量與比例的比較、各基因mRNA相對表達(dá)量三組及以上的組間比較、各蛋白Western Blotting條帶的相對灰度值三組及以上的組間比較、經(jīng)空白組校正后的HepG2細(xì)胞內(nèi)TCHO/TP組間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD法;方差不齊時采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett's T3法;各基因mRNA相對表達(dá)量兩組間比較、

14、各蛋白Western Blotting條帶相對灰度值兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、HepG2細(xì)胞不同血清濃度的細(xì)胞密度的區(qū)別沒有統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.008，P=0.992），不同時間點(diǎn)的細(xì)胞密度的區(qū)別則有統(tǒng)計學(xué)意義(F=272.9，P＜0.001)。不同匯合度下，活細(xì)胞數(shù)量、死細(xì)胞數(shù)量以及活細(xì)胞死細(xì)胞比例均不全相同(P＜0.001)，活細(xì)胞數(shù)隨著匯合度的增加而增加

15、，在匯合度達(dá)到90％和100％時升至最高，繼續(xù)培養(yǎng)反而下降;死細(xì)胞數(shù)在匯合度達(dá)到90％及以前均變化不大，但在達(dá)到100％后迅速增加，繼續(xù)培養(yǎng)上升明顯;而活細(xì)胞與死細(xì)胞的比例在匯合度達(dá)到至80％和90％時升至最高，隨后又下降。在不使用PBS沖洗時，需要大約5分鐘時間貼壁細(xì)胞才能完全消化，但使用PBS沖洗后，僅需要2分鐘就可以使貼壁細(xì)胞完全消化，并且沖洗次數(shù)的增加并沒有使消化時間相應(yīng)縮短。
　　 對于siRNA片段的篩選，相同條件下

16、siRNA Segement1的干擾效果最好，使用50nM的終濃度對HepG2細(xì)胞干擾24小時后，Nur77mRNA的相對表達(dá)量可降至79％左右。不同干擾時間達(dá)到的Nur77mRNA干擾效果各組間不盡相同(F=54.7，P＜0.001)，隨著干擾時間的增加，Nur77mRNA的相對表達(dá)量先下降后上升，其中干擾36h組的干擾效果最好，可將Nur77mRNA沉默至25％左右。不同siRNA濃度Nur77mRNA的干擾效果不盡相同(F=238

17、，P＜0.001)，隨著siRNA用量的增加，Nur77mRNA的相對表達(dá)量逐漸下降，siRNA用量最大(100nM)時Nur77mRNA的相對表達(dá)量可降至10％左右。使用以上條件對HepG2細(xì)胞Nur77實(shí)施干擾，實(shí)驗(yàn)組(siRNA-Nur77) Nur77mRNA的相對表達(dá)量降至10％左右（P＜0.001 vs.陰性對照），Westem Blotting蛋白條帶相對灰度值降至54％左右（P=0.004 vs.陰性對照），沉默效果明顯

18、。
　　 2、通過酶切電泳與測序鑒定，成功構(gòu)建了Nur77過表達(dá)載體pcDNA3.1-Nur77。并且其可以有效轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑的比例為1:2.5（μg∶μL）轉(zhuǎn)染48小時后，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80％左右。與對照組pcDNA3.1-monk相比，實(shí)驗(yàn)組pcDNA3.1-Nur77的mRNA相對表達(dá)量升高至大約500倍（P＜0.001vs.陰性對照），Western Blotting條帶相

19、對灰度值升高至大約3.7倍(P=0.001vs.陰性對照)，過表達(dá)效果顯著。
　　 3、各組細(xì)胞經(jīng)空白組校正后的總膽固醇水平（TCHO/TP）的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=107.5，P＜0.001）。其中Nur77 RNA干擾組較干擾陰性對照組升高至1.3倍左右(1.34±0.04 vs.1.04+0.03，P＜0.001)，Nur77過表達(dá)組相比過表達(dá)陰性對照組降至76％左右(0.74±0.01 vs.0.97±0.06，P＜0.

20、001)，相應(yīng)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。油紅O染色證實(shí)了上述細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的改變。對于肝細(xì)胞膽固醇代謝的主要調(diào)控基因，在Nur77抑制之后LDLR mRNA相對表達(dá)量相比對照組升高至1.7倍左右（1.836±0.104 vs.1.108±0.056），Western Blotting蛋白條帶的相對灰度值相比對照組升高至1.5倍左右（1.167±0.105 vs.0.797±0.075），而在Nur77過表達(dá)之后LDLR mRNA相對表達(dá)量

21、相比過表達(dá)對照組降低至45％左右(0.412±0.067 vs.0.925±0.068)，Western Blotting蛋白條帶的相對灰度值相比過表達(dá)對照組降低至46％左右(0.300±0.046 vs.0.653±0.045)，相應(yīng)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。對于HMGCR，在Nur77抑制之后mRNA相對表達(dá)量相比對照組升高至1.8倍左右（1.608±0.105 vs.0.914±0.041），Western Blott

22、ing蛋白條帶的相對灰度值相比對照組升高至1.4倍左右(1.593±0.125 vs.1.103±0.081)，而在Nur77過表達(dá)之后mRNA相對表達(dá)量相比過表達(dá)對照組降低至51％左右（0.570±0.081 vs.1.116±0.054），Western Blotting蛋白條帶的相對灰度值相比過表達(dá)對照組降低至54％左右(0.510±0.046 vs.0.943±0.075)，相應(yīng)差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。然而，Lx

23、Rα mRNA相對表達(dá)量與Western Blotting蛋白條帶的相對灰度值并不隨Nur77的改變而明顯變化。
　　 4、HepG2細(xì)胞經(jīng)10μg/mLCsnB處理后各時間點(diǎn)間Nur77 mRNA相對表達(dá)量變化明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.1，P＜0.001)。在處理后1.5h達(dá)到高峰，大約為0h的2.65倍，隨后開始下降，在12h基本降至基礎(chǔ)水平。LDLR在CsnB處理后mRNA相對表達(dá)量呈下降的表現(xiàn)，尤其是在作用時間增

24、至12h與24h時下降明顯，不同時間點(diǎn)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=60.7，P＜0.001);LDLR在DMSO處理后mRNA相對表達(dá)量也呈下降的表現(xiàn)，但是其下降趨勢與CsnB處理組相比明顯放緩;對于24h時間點(diǎn)，LDLR的mRNA相對表達(dá)量在CsnB處理組與DMSO對照組之間的差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.6，P=0.003）。HMGCR在CsnB處理后mRNA相對表達(dá)量呈下降的表現(xiàn)，不同時間點(diǎn)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.0，

25、P=0.003）;而CsnB處理組相比DMSO對照組HMGCR mRNA相對表達(dá)量下降明顯（F=4.6，P=0.042）。而對于LxRα，其在CsnB處理后mRNA相對表達(dá)量變化并不明顯，不同時間點(diǎn)之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.7，P=0.612);CsnB處理組與DMSO對照組相比差異也沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.3，P=0.266)。
　　 結(jié)論:
　　 1、對于本實(shí)驗(yàn)室獲得的HepG2細(xì)胞，使用10％血清濃度的DM

26、EM培養(yǎng)基對HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在匯合度達(dá)到90％左右時進(jìn)行傳代，傳代時用PBS對貼壁細(xì)胞沖洗一次，然后用胰酶消化可以獲得較好的效果。基于本實(shí)驗(yàn)室的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)條件與RNA干擾條件，siRNA Segement1是最佳的siRNA片段，使用100nM的終濃度干擾36h可以獲得較好的Nur77mRNA干擾效果。
　　 2、通過分子克隆成功構(gòu)建了Nur77過表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Nur77，與Lipofectami

27、ne 2000轉(zhuǎn)染試劑的比例為1:2.5（μg∶μL）轉(zhuǎn)染48小時后，能夠在HepG2細(xì)胞中達(dá)到較好的過表達(dá)Nur77的效果。
　　 3、Nur77參與了HepG2細(xì)胞膽固醇代謝的調(diào)控，可以降低HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的水平。這種作用可能與Nur77降低HepG2細(xì)胞LDLR與HMGCR的水平有關(guān)。
　　 4、Nur77的天然激動劑CsnB可以有效地誘導(dǎo)Nur77在HepG2細(xì)胞中的高表達(dá)，并且可以使HepG2細(xì)胞LDLR