2型糖尿病患者膽固醇外流的功能改變及機制研究.pdf

1、2型糖尿病患者動脈粥樣硬化心腦血管疾病的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非2型糖尿病患者，其存在多重致動脈粥樣硬化因素，其中高密度脂蛋白(HDL)數(shù)量及其介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能異常在糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。巨噬細(xì)胞膽固醇外流是膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中的重要的初始步驟，本研究主要就膽固醇外流功能在2型糖尿病患者中的異常調(diào)節(jié)進(jìn)行探討。
　　 研究目的：
　　 1.探討不同人群外周血單核巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1的mRNA及蛋

2、白的表達(dá)情況。
　　 2.通過以HDL、ApoA1及血清為接受體，研究不同人群單核巨噬細(xì)胞的膽固醇外流功能。
　　 3.研究不同人群單核巨噬細(xì)胞的核因子肝X受體(LXR)的mRNA表達(dá)，同時通過電泳遷移率試驗探討LXR對ABCG1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 1.按WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)選取單純2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病患者，同時選取年齡與性別匹配的健康人群作為及正常對照組，抽取外周靜脈血40m

3、l，進(jìn)行血脂、血糖等生化指標(biāo)的檢測，ELISA血游離脂肪酸(FFA)水平。
　　 2.Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，免疫磁珠法分選單核細(xì)胞，M-CSF刺激培養(yǎng)使單核細(xì)胞巨噬化。油紅0及CD68免疫組化染色鑒定巨噬細(xì)胞。
　　 3.Real-TimePCR方法檢測人單核巨噬細(xì)胞上ABCA1、ABCG1的mRNA表達(dá)。
　　 4.WesternBlot方法檢測人單核巨噬細(xì)胞上的ABCA

4、1和ABCG1的蛋白表達(dá)。
　　 5.H3膽固醇標(biāo)記巨噬細(xì)胞，以HDL為接受體，觀察以BLT-1阻斷SR-B1通路后經(jīng)ABCG1通路的膽固醇外流；以apoAl為接受體，觀察經(jīng)ABCA1通路的膽固醇外流；并以患者的自身血清和標(biāo)準(zhǔn)血清為接受體，觀察患者血清介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流能力的變化。
　　 6.用Real-TimePCR檢測核因子LXRα、LXRβ的mRNA表達(dá)水平。
　　 7.電泳遷移率試驗(EMSA)檢測

5、LXR與ABCG1啟動子區(qū)地LXRE結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)，從而探索LXR對ABCG1轉(zhuǎn)錄的影響。
　　 8.統(tǒng)計分析:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以X±SD表示，組間比較以one-wayANOVA進(jìn)行分析，線性相關(guān)應(yīng)用Pearson's相關(guān)分析，回歸分析采用多重線性回歸分析方法。
　　 結(jié)果：
　　 1.受試者一般特征及生化指標(biāo)概括:包括正常對照組15例，單純糖尿病組15例，糖尿病合并冠心

6、病組15例，共45例。單純糖尿病組與糖尿病合并冠心病組患者的空腹血糖水平顯著高于對照組，HbAlc水平高于正常值；單純糖尿病HDL-C、Hs-CRP低于正常對照組，余指標(biāo)在各組間無顯著差異。
　　 2.Real-TimePCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者ABCG1的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(2.26±0，86vs0.83±0.26，P<0.001)，而ABCA1的表達(dá)則無顯著改變(2.36±3.20vs2.34±2.88，P=0.

7、98)。ABCG1mRNA表達(dá)的多重線性回歸分析顯示:HbAlc與ABCG1的mRNA表達(dá)呈線性回歸關(guān)系，ABCG1的mRNA表達(dá)與HbAlc水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.057，P=0.038)，HbAlc可能為ABCG1表達(dá)的重要影響因素。
　　 3.WesternBlot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的ABCG1的蛋白表達(dá)水平也顯著下降，而ABCA1的蛋白表達(dá)在各組之間無顯著差異存在。
　　 4.HDL介導(dǎo)的經(jīng)ABCG1

8、通路的膽同醇外流率及自身血清和標(biāo)準(zhǔn)血清介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流率在2型糖尿病患者中均顯著下降(P均<0.01)；而ApoA1介導(dǎo)的經(jīng)ABCA1通路的膽固醇外流率在單純2型糖尿病患者中與對照組無明顯差異(P=0.09)，在糖尿病合并冠心病組患者卻顯著低于正常對照組(P=0.04)。
　　 5.Real-TimePCR檢測LXRa與LXRp的mRNA表達(dá)在正常對照組與2型糖尿病組之間未存在顯著差異(P=0.81，P=0.63)。

9、r>　　 6.EMSA檢測LXR與ABCG1啟動子結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)在2型糖尿病與正常對照組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P=0.16)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在2型糖尿病患者中，巨噬細(xì)胞ABCG1的基因及蛋白表達(dá)顯著下降，而ABCA1的基因及蛋白表達(dá)則無明顯改變。
　　 2.2型糖尿病患者血清介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流能力明顯受損，以ABCG1通路介導(dǎo)的膽固醇外流下降為主，ABCA1通路介導(dǎo)的膽固醇外流在單純