阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者膽固醇外流功能的改變及機(jī)制研究.pdf

1、背景
　　 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnoea hypopneasyndrome，OSAHS）作為嚴(yán)重影響人類健康的常見疾病，目前被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究也發(fā)現(xiàn)，心血管疾病可能發(fā)生在OSAHS的早期，甚至在沒有經(jīng)典的心血管疾病危險(xiǎn)因素的OSAHS患者中發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，早發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化是OSAHS患者心血管疾病發(fā)病率和病死率升高的原因之一。動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期標(biāo)志是

2、巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，并在動(dòng)脈壁沉積。高密度脂蛋白（HDL）及其介導(dǎo)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）是機(jī)體抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要機(jī)制之一，巨噬細(xì)胞膽固醇外流是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的重要的初始步一驟，而三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCAl）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ATP binding cassette transporter G1，ABCGl）和清道夫受體B1

3、（scavenger receptor class B1，SR-BI）都是重要的介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的細(xì)胞表面蛋白。目前已知在炎癥、脂質(zhì)紊亂以及糖代謝異常等疾病過程中，這一過程障礙導(dǎo)致的保護(hù)功能喪失是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因。睡眠呼吸暫停在動(dòng)脈粥樣硬化形成中所起的重要的作用已得到人們重視，也有研究已經(jīng)證實(shí)在體外OSAHS患者的HDL-C功能存在異常，但其具體機(jī)理仍不清楚。
　　 目的
　　 1.通過對(duì)OSAHS患者

4、外周血單核巨噬細(xì)胞膽固醇外流功能及其相關(guān)受體的研究，探討OSAHS患者早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制。
　　 2.建立OSAHS鼠模型，并在OSAHS鼠動(dòng)脈內(nèi)膜及腹腔巨噬細(xì)胞中，觀察間斷低血氧對(duì)于膽固醇外流及其相關(guān)受體以及對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。
　　 方法
　　 1.收集北京協(xié)和醫(yī)院經(jīng)多導(dǎo)睡眠圖（polysomnography，PSG）確診的OSAHS患者和年齡及性別匹配的健康對(duì)照，根據(jù)AHI（呼吸紊亂指數(shù)，ap

5、nea hyponea index，AHI）將其分為三組：對(duì)照組，輕中度OSAHS組，重度OSAHS組，所有受試者均抽取外周靜脈血30ml，進(jìn)行血脂、血糖、hsCRP等生化指標(biāo)的檢測(cè)。
　　 2.采用密度梯度離心和粘附法分離、純化人外周血單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)并巨噬化后，在mRNA水平，用RT PCR方法研究人單核巨噬細(xì)胞上ABCAl、ABCGl和SR-BI的表達(dá)水平；在蛋白水平，用Western Blot方法檢測(cè)人單核巨噬細(xì)胞上的

6、ABCAl的蛋白表達(dá)。
　　 3.使人外周血單核巨噬細(xì)胞負(fù)載3H放射性同位素標(biāo)記的膽固醇，分別用空白對(duì)照、自身血清、HDL及APOAl誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，測(cè)定膽固醇外流率。
　　 4.成功建立OSAHS鼠動(dòng)物模型，并于間斷低氧處理18周時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離鼠主動(dòng)脈，觀察其動(dòng)脈內(nèi)皮動(dòng)脈粥樣硬化病變情況。
　　 5.收集鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別研究對(duì)照組和間斷低氧組兩組鼠腹腔巨噬細(xì)胞ABCAl、ABCGl和SR-BI的m

7、RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)情況，并應(yīng)用3H放射性同位素法測(cè)定鼠巨噬細(xì)胞膽固醇外流率。
　　 6.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以X±SD表示，組間比較以one-way ANOVA進(jìn)行分析，線性相關(guān)應(yīng)用Pearson’s相關(guān)分析，回歸分析采用多重線性回歸分析方法。
　　 結(jié)果：
　　 1.在對(duì)照組、輕中度OSAHS組和重度OSAHS組三組之間，AHI（2.14±1.28，18.77±8.50

8、 vs62.9±20.7）、Hs-CRP（0.366±0.19，1.02±0.68 vs4.95±3.45）、平均血氧飽和度（96.6±1.34，95±1.73 vs93.5±1.22）和最低血氧飽和度（92.4±1.82，87±6.24 vs76.1±4.92）均存在顯著性差異（P均<0.05），其余所有指標(biāo)包括年齡、性別、BMI、腰圍、血壓、血糖及各種血脂指標(biāo)的水平等在三組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.RT PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)

9、現(xiàn)與對(duì)照組（0.534±0.012）相比，輕中度（0.394±0.037）和重度OSAHS組患者（0.344±0.039）單核巨噬細(xì)胞表面ABCAl mRNA的表達(dá)顯著降低（P均<0.05），其降低程度與OSAHS嚴(yán)重程度一致。輕中度OSAHS患者（0.37334±0.02）與重度OSAHS患者（0.3544±0.03）和對(duì)照組（0.48084±0.02）相比，ABCGl的表達(dá)是也明顯降低的（P<0.05），但是在輕中度OSAHS組和重

10、度OSAHS組之間沒有觀察到顯著性差別（P=0.21）。對(duì)照組、輕中度OSAHS組和重度OSAHS組SR-BI mRNA的表達(dá)（0.35814±0.03，0.364±0.02，0.394±0.05）在各組間無(wú)顯著差別（p均>0.05）。
　　 3.Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著睡眠呼吸障礙的程度加重，ABCAl的蛋白表達(dá)水平明顯下降。
　　 4.在正常對(duì)照組患者、輕中度OSAHS組和重度OSAHS組患者中，A

11、poAl誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的膽固醇外流率分別為：13.3％±3.9％，6.6％±2.1％，3.3％±1.6％（患者與對(duì)照組相比P均<0.01）；HDL誘導(dǎo)的膽固醇外流率分別為：10.5％±12.5％，9.4％±10.2％，6.9％±7.2％，有下降趨勢(shì)（P分別為0.59、0.34和0.32）；自身血清誘導(dǎo)的膽固醇外流水平分別為：17.5％±5.4％，9.4％±3.2％，5.5％±1.9％，三組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0

12、.01）。
　　 5.多重線性回歸分析及Pearson’s相關(guān)分析均顯示：ABCAl的表達(dá)水平與AHI之間存在負(fù)相關(guān)（r=-0.831，p<0.001），血清介導(dǎo)的膽固醇外流率和ApoAl介導(dǎo)的膽固醇外流率與AHI之間也都存在負(fù)相關(guān)（分別為r=-0.917，r=-0.880，P<0.001），提示隨著AHI的升高，ABCAl的表達(dá)水平、ApoAl介導(dǎo)的通過ABCAl作用的膽固醇外流率及血清介導(dǎo)的膽固醇外流率都是降低的。
　

13、　 6.間斷低氧處理至18周時(shí)，金黃地鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮均未見明顯粥樣斑塊或脂質(zhì)條紋形成。
　　 7.18周時(shí)間斷低氧的金黃地鼠巨噬細(xì)胞表面ABCAl、ABCGl和SRBI三種受體的mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比，均有不同程度的增加。分別為0.46±0.03 vs0.36±0.02，0.60454±0.12 vs0.41±0.03，0.63±0.15 VS0.3486±0.04（P均<0.05）。
　　 8.Western Bl

14、ot結(jié)果提示，在間斷低氧組金黃地鼠的腹腔巨噬細(xì)胞上，ABCAl、ABCGl的蛋白表達(dá)都是增高的。
　　 9.在對(duì)照組和OSAHS組金黃地鼠中，ApoAl、HDL和自身血清誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞的膽固醇外流率分別為：38.5％±8.5％vs45.8％±9.0％（P=0.833），52.9％±2.8％VS70.5％±4.5％（P=0.1），40.7％±12.1％vs65.5％±4.4％（P=0.197），間斷低氧組的膽固醇外流率比對(duì)照組均

15、有增高趨勢(shì)，但都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論
　　 1.在OSAHS患者中，單核巨噬細(xì)胞ABCAl的基因及蛋白表達(dá)顯著下降，并且隨著睡眠呼吸暫停的程度加重，其下降趨勢(shì)越來(lái)越明顯。
　　 2.OSAHS患者巨噬細(xì)胞膽固醇外流能力明顯受損，以ABCAl通路介導(dǎo)的膽固醇外流下降為主。
　　 3.ABCAl、ABCGl的mRNA表達(dá)及血清和APOA1介導(dǎo)的膽固醇外流能力均與AHI呈顯著負(fù)相關(guān)，AHI是影響OSAH