肝X受體介導腎小球系膜細胞膽固醇外流.pdf

1、慢性腎衰竭是一種嚴重威脅人民健康的疾病，腎小球硬化是慢性腎衰竭的重要致病因素。對于腎小球硬化機制的研究表明，腎小球局部脂質(zhì)代謝異?？赡茉谀I小球硬化的發(fā)生過程中有重要作用，旨在降低循環(huán)和腎臟局部脂質(zhì)負荷的方法也發(fā)現(xiàn)可以減輕和延緩腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展，因而闡明腎臟脂質(zhì)代謝機制對預防和治療腎小球硬化具有重要的意義。已有的研究表明，脂質(zhì)聚集在系膜細胞中會導致其轉(zhuǎn)變成泡沫樣細胞，引起腎小球硬化而喪失原有的功能，因此系膜細胞中的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)在腎臟

2、中顯得尤為重要。 本研究旨在探討肝X受體(liverXreceptor，LXR)在小鼠腎臟系膜細胞脂質(zhì)代謝中的作用及機制。我們的研究發(fā)現(xiàn)LXR特異性激動劑TO901317刺激培養(yǎng)的家兔系膜細胞后，轉(zhuǎn)染的ABCA1熒光素酶報告基因活性增加。而用TO901317處理培養(yǎng)的小鼠系膜細胞24小時后，基因芯片結(jié)果也顯示ABCA1基因表達被上調(diào)。因此我們推測在小鼠腎小球系膜細胞中，LXR可能通過上調(diào)ABCA1的表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。

3、另外，由于ABCG1也是LXR的靶基因，且同ABCA1以相似的方式調(diào)節(jié)機體膽固醇的代謝，所以同時觀察了在小鼠腎小球系膜細胞中LXR對ABCG1的調(diào)節(jié)作用。 方法：LXR具有兩種亞型LXRα和LXRβ，為了評估LXRα和LXRβ在腎臟的表達，我們用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)分析了腎臟、新鮮分離的腎小球及系膜細胞中兩種亞型的mRNA表達水平。另外我們也提取了腎臟核蛋白和系膜細胞總蛋白，并使用免疫印跡(Westernblo

4、tting)實驗方法研究了在腎臟和腎小球系膜細胞中LXRα和LXRβ蛋白水平的表達。此外，我們建立了原代小鼠系膜細胞的培養(yǎng)方法并用1-5代系膜細胞，給予LXR激動劑TO901317(10μmol/L)或溶劑二甲基亞楓(DMSO)處理24小時，進行以下幾個方面的研究：(1)實時熒光定量PCR(Quantitativereal-timePCR)觀察ABCA1和ABCG1在TO901317刺激后表達水平的變化。(2)轉(zhuǎn)染人ABCA1熒光素酶報

5、告基因方法研究TO901317對ABCA1啟動子活性的影響。(3)Westernblotting觀察系膜細胞轉(zhuǎn)染了LXRα腺病毒后再予以TO901317刺激，ABCA1蛋白水平的變化。(4)[3H]標記膽固醇方法測量系膜細胞予以TO901317處理后游離膽固醇的外流量。 結(jié)果：首先我們分別從mRNA和蛋白水平證實LXR兩種亞型在小鼠腎臟、腎小球、系膜細胞中均有表達。LXR激動劑TO901317(10μmol/L)處理系膜細胞后，

6、實時熒光定量PCR結(jié)果顯示ABCA1mRNA水平增加約2.6倍(p＜0.01，n=6)。同時我們觀察了ABCG1mRNA水平的變化，同對照組相比，TO901317也使其表達增加了約2.5倍(p＜0.05，n=3)。為了進一步研究LXR激動劑上調(diào)ABCA1mRNA水平的分子機制，系膜細胞轉(zhuǎn)染了人ABCA1熒光素酶報告基因后，再予以TO901317(10μmol/L)處理24小時，結(jié)果同對照組相比，實驗組ABCA1啟動子活性即熒光值明顯增加

7、(p＜0.01，n=6)。接下來我們在系膜細胞中轉(zhuǎn)入LXRα腺病毒使其過度表達LXRα24小時后，再給予TO901317處理24小時，免疫印跡分析顯示TO901317能在蛋白水平增加ABCA1的表達。用[3H]標記膽固醇對系膜細胞膽固醇外流的研究表明TO901317能夠增加游離膽固醇的流出，加入ApoAI后外流的游離膽固醇明顯增多。 結(jié)論：小鼠系膜細胞中存在LXRα和LXRβ的基礎(chǔ)表達，LXR激動劑不僅可以上調(diào)ABCA1的表達，