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文檔簡介
1、目的:
建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,觀察5-羥葵酸阻斷吡那地爾后處理對缺血再灌注損傷大鼠心臟功能的影響,利用蛋白組學(xué)研究技術(shù)觀察心肌線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。
方法:
1.建立Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型:將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組(Nor)、缺血再灌注損傷組(I/R)、吡那地爾后處理組(Pina)、5-羥葵酸阻斷吡那地爾后處理組(5-HD+Pina),每組8只
2、:
各組灌注方案:Nor組:持續(xù)灌注Kerbs-Henseleit緩沖液(K-H液)120 min,無缺血再灌注損傷。I/R組、Pina組、5-HD+Pina組,缺血前灌注K-H液平衡20min后,灌注4℃ ST.Thomas停跳液,使全心停跳缺血40 min,分別按以下方案續(xù)灌:I/R組:灌注K-H液60 min;Pina組:灌注K-H液前給予50μmol/L吡那地爾2 min,繼之K-H液58min;5-HD+Pina
3、組:依次灌注100μmol/L5-羥葵酸3min、50μmol/L吡那地爾2 min、K-H液55 min。記錄各組平衡末和續(xù)灌末心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVDEP)、以及最大dp/dt等心功能的變化,并收集心室肌組織:
2.差速離心及Nycodenz密度梯度離心提取、純化大鼠心肌線粒體,并利用Western blot檢測亞細(xì)胞器標(biāo)識物以驗證其純度;
3.Pina組與5-HD+Pi
4、na組心肌線粒體蛋白行雙向凝膠電泳(2-DE)、染色、凝膠掃描后獲得2-DE圖像,以PD-Quest8.0軟件分析各組差異表達(dá)蛋白點(diǎn),并將各蛋白點(diǎn)挖取、酶解、質(zhì)譜分析后獲得差異蛋白的譜圖;
4.利用Western blot回復(fù)驗證關(guān)鍵差異蛋白的表達(dá)趨勢,以判斷2-DE結(jié)果的可靠性。
結(jié)果:
1.利用Nycodenz密度梯度離心法進(jìn)一步的提高了線粒體的純度;
2.平衡末各組間心功能無
5、明顯差異,灌注末Nor組及Pina組的心功能明顯好于I/R組和5-HD+Pina組(P<0.05),5-HD+Pina組與I/R組間心功能差異無統(tǒng)計學(xué)意義;
3.兩組蛋白進(jìn)行2-DE,得到聚焦良好、相似性高的圖像,在兩組膠上平均檢測出485±22個蛋白斑點(diǎn);經(jīng)分析后得到9個差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn),質(zhì)譜分析成功獲得差異蛋白譜圖;
4.通過分析,與Pina組比較在5-HD+Pina組表達(dá)下降的分別為:Spot5
6、202、5205(NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物10亞基,NDUFA10),Spot6001(ATP合酶α亞基,ATPA);表達(dá)升高的6個蛋白分別為:Spot2404(長鏈脂酰輔酶A脫氫酶,ACADL),Spot5301(NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物10亞基,NDUFA10),Spot5402(NADH脫氫酶鐵-硫蛋白2,NDUFS2),Spot5503(乙醛脫氫酶2,ALDH2),Spot6603(二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶,丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的
7、組成部分,ODP2),Spot6807(線粒體內(nèi)膜蛋白,IMMT)。其中Spot5202、5205、5301經(jīng)質(zhì)譜鑒定均為NDUFA10,兩個表達(dá)下調(diào),一個表達(dá)升高。
5.Western blo回復(fù)驗證,在5-HD+Pina組中NDUFA10、NDUFS2及ALDH2較Pina組升高,ATPA較Pina組下降,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:
1.吡那地爾后處理能明顯改善大鼠心臟功能
8、,而5-羥葵酸可部分拮抗其保護(hù)作用;
2.5-羥葵酸阻斷吡那地爾后處理(線粒體敏感性心通道的開放被阻斷),可導(dǎo)致:
①心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷引起ATPA表達(dá)下調(diào),其原因可能是ATPA的轉(zhuǎn)運(yùn)尤其是跨膜過程受損;Pina可以維持線粒體內(nèi)ATPA的穩(wěn)定表達(dá);
②ACADL、NDUFS2、ODP2、IMMT、ALDH2表達(dá)上調(diào);可能是由于線粒體內(nèi)H+增加、pH升高、ATP合成減少、醛類物質(zhì)堆積等原因
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