脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體的功能和比較蛋白質組學研究.pdf

1、背景：
　　中醫(yī)學認為“脾”是“氣血生化之源，后天之本”，主要功能是運化水谷精微和水液，以保證機體得到充足的能量供應，維持體內水液正常代謝。長期飲食肥高厚味（高熱量食物）能夠導致脾運化功能失代償，機體能量代謝異常，以及異常代謝物質堆積在體內不能及時代謝排出體外，引起中醫(yī)證候痰濕。線粒體是細胞內呼吸和能量產生的主要場所，通過氧化磷酸化過程產能為細胞代謝活動提供能量，維持生命活動的正常進行。線粒體氧化磷酸化產能過程與中醫(yī)“脾”運化功能

2、有許多共同之處，1987年劉友章教授首次提出“中醫(yī)脾-線粒體”相關理論，指出脾主運化不僅指是食物在消化道吸收，更重要的是指在線粒體內的氧化磷酸化過程。研究發(fā)現(xiàn)脾虛證患者線粒體結構和功能存在異常，證實中醫(yī)脾和線粒體存在聯(lián)系。
　　目的：
　　1.根據(jù)脾虛痰濕證臨床病癥制定的脾虛痰濕證大鼠模型評價標準，確定脾虛痰濕證模型復制的方法。
　　2.分析脾虛痰濕證大鼠肝臟病理變化，為脾虛痰濕證提供病理診斷依據(jù)。
　　3.揭示

3、脾虛痰濕疾病狀態(tài)下線粒體功能變化，從現(xiàn)代分子生物學角度探討脾運化失常與線粒體的關系。
　　4.篩查線粒體蛋白質組，初步了解脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體蛋白質變化，從整體角度闡述線粒體蛋白質異常與線粒體功能變化的關系，從而揭示脾虛痰濕證發(fā)生的分子生物學機理。
　　方法：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)SPF級SD雄性成年大鼠，監(jiān)測大鼠脾虛痰濕證相關癥狀表現(xiàn)。運用代謝籠檢測24h飲食量，曠場試驗評價精神狀態(tài)，抓力計檢測肌張力，同時觀察檢

4、測大鼠皮毛、體重和血脂，根據(jù)類人癥狀模型標準確定大鼠是否出現(xiàn)脾虛痰濕證。
　　2.記錄大鼠肝臟外觀和重量，組織病理切片HE染色觀察肝細胞形態(tài)變化，結合生化血脂指標分析脾虛痰濕證與脂肪肝的聯(lián)系。
　　3.差速離心法粗提肝臟組織線粒體，用于線粒體功能檢測;Percoll分離液純化線粒體，Western blotting檢測線粒體提取效果，用于線粒體蛋白質組學研究。
　　4.Real-time PCR測定線粒體DNA(mtD

5、NA)相對拷貝數(shù)。
　　5.運用試劑盒檢測脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體膜電位和ATP含量變化。
　　6.分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ-Ⅳ活性，ATP合酶試劑盒檢測線粒體ATP合酶活性，評價脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體氧化磷酸化功能變化。
　　7.同重同位素相對與絕對定量（iTRAQ）技術、Mascot軟件和UniprotRat數(shù)據(jù)庫對線粒體蛋白質進行鑒別定量對比分析，查找脾虛痰濕證脾運化失常與線粒體異常的相關性蛋白質，運

6、用GO數(shù)據(jù)庫進行功能分析。
　　8.Western blotting檢測線粒體蛋白質ATP5A、TFAM、Ndufa5和CYTB表達量，驗證iTRAQ鑒定蛋白質組的結果。
　　結果：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)SPF級SD雄性大鼠16周后，出現(xiàn)體質肥胖、食欲下降、精神疲乏活動減少、皮毛顏色枯黃無光澤等脾虛痰濕證癥狀。
　　2.高脂飼養(yǎng)16周后，脾虛痰濕證大鼠血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量增加，肝臟外觀肥大油膩，病

7、理顯示肝細胞內含有大量大小不等的脂肪空泡和肝細胞玻璃樣變伴炎癥細胞浸潤，可見纖維化。
　　3.運用差速離心法加percoll分離液純化得到的線粒體基本不含胞漿蛋白，適用于線粒體蛋白質組研究。
　　4.與正常組對比，脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體DNA拷貝數(shù)減少，膜電位下降，ATP含量減少，呼吸鏈復合體Ⅰ和Ⅲ活性下降，復合體Ⅱ、Ⅳ和ATP合酶無明顯變化，線粒體數(shù)量無變化。
　　5.對純化的線粒體蛋白質組鑒定對比分析得到61個脾

8、虛痰濕證大鼠差異表達蛋白質，顯著上調30個，顯著下調31個，主要涉及線粒體氧化磷酸化和脂質代謝、脂肪酸氧化和乙酰輔酶A代謝過程，并且與氧化磷酸化過程相關的11個蛋白質表達量均下調。
　　結論：
　　1.長期高脂飲食能夠導致大鼠脾運化失常出現(xiàn)脾虛痰濕證，并且為非酒精性脂肪肝型脾虛痰濕證。
　　2.脾虛痰濕證大鼠線粒體功能損傷，證明脾運化失常與線粒體功能異常密切相關。
　　3.線粒體氧化磷酸化相關蛋白表達量下調與線粒