比較蛋白質組學研究大鼠感覺與運動神經差異表達蛋白.pdf

1、目的：采用相對和絕對定量的等量異位標簽(iTRAQ)偶聯在線二維液相色譜串聯質譜(2D LC-MS/MS)的定量蛋白質組學技術，建立大鼠感覺與運動神經的全蛋白質組表達譜，通過定量分析得到差異表達蛋白；采用UniProt蛋白數據庫和PubMed等生物信息學工具對全蛋白表達譜和差異表達蛋白根據生物學功能進行分類。從蛋白水平分析感覺與運動神經功能差異的物質基礎，并為進一步深入探討感覺與運動神經特異性再生的機制提供科學依據。
　　方法：<

2、br>　　1、根據解剖學結構分離感覺與運動神經，取材備用；提取蛋白樣品，采用Bradford法測定總蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白樣品的質量。
　　2、蛋白樣品經過丙酮沉淀，酶解，iTRAQ標記后，使用AnalystTM1.1軟件控制Nano-HPLC system和hybrid Q-TOF mass spectrometer(QSTAR XL)并采集數據。
　　3、通過ProteinPilotTM4.0軟件鑒

3、定并定量多肽和蛋白質。
　　4、蛋白質組學分析中獲得的全蛋白表達譜和差異表達蛋白通過檢索 Uniprot蛋白數據庫和PubMed數據庫，根據其生物學功能進行分類。
　　5、通過Western blot和qRT-PCR方法分別對感覺與運動神經差異表達蛋白及基因進行驗證。
　　6、通過免疫組化染色對感覺與運動神經差異表達蛋白進行定位分析。
　　結果：
　　1、根據解剖學結構，成功獲得感覺與運動神經。SDS-PA

4、GE電泳的結果顯示感覺與運動神經蛋白樣品品質較佳。
　　2、經 ProteinPilotTM4.0軟件分析，獲得感覺與運動神經全蛋白質組表達譜。以蛋白置信度>95％或ProtScore>1.3為限，共鑒定了1472個非冗余蛋白，并根據生物學功能分類。
　　3、蛋白質組學檢測的1472個非冗余蛋白以90%可信區(qū)間計算117/116（感覺神經/運動神經）的比值，比值≥2.0237的為感覺神經高表達蛋白；≤0.5010的為運動神經

5、高表達蛋白。結果發(fā)現有100個顯著差異表達蛋白，其中56個為感覺神經高表達、運動神經低表達蛋白，44個為運動神經高表達、感覺神經低表達蛋白。
　　4、56個感覺神經高表達蛋白根據生物學功能分類，其中40個可以分為以下10類，包括：細胞粘附蛋白、肌動蛋白結合蛋白、鈣結合蛋白、信號轉導蛋白、神經元可塑性調節(jié)蛋白、酶、脂代謝蛋白、DNA結合蛋白、SNAP復合體蛋白和ATP結合蛋白，其余16個歸為雜類和未鑒定蛋白。
　　5、44個運

6、動神經高表達蛋白根據生物學功能分類，其中35個可以分為以下12類，包括：細胞骨架蛋白、細胞外基質分子、氧化還原通路相關蛋白、神經營養(yǎng)因子、肌動蛋白結合蛋白、信號轉導蛋白、轉運蛋白、鈣結合蛋白、酶、酶抑制劑、脂代謝蛋白和ATP結合蛋白，其余9個歸為雜類和未鑒定蛋白。
　　6、通過qRT-PCR分別對100個差異表達蛋白中的20個感覺神經高表達蛋白與14個運動神經高表達蛋白進行驗證，結果與蛋白質組學的檢測一致。
　　7、 Wes

7、tern blot結果顯示CALB2，CNPase和SNAP-25在感覺神經中高表達， CNTF，NFh，NES和VIM在運動神經中高表達，結果與蛋白質組學的檢測一致。
　　8、免疫組化結果顯示CNPase，NCAM1和L1與施萬細胞的標記物S100共定位；CALB2和SNAP-25既與神經元標記物NF200共定位，也與施萬細胞的標記物S100共定位。提示CNPase，NCAM1和L1的差異表達由施萬細胞產生，而CALB2和SNA

8、P-25的差異表達既由神經元，也由施萬細胞產生。
　　結論：
　　1、通過iTRAQ偶聯2D LC-MS/MS的定量蛋白質組學技術，在建立大鼠感覺與運動神經的全蛋白質組表達譜的基礎上，通過定量分析得到100個差異表達蛋白，其中56個為感覺神經高表達、運動神經低表達蛋白，44個為運動神經高表達、感覺神經低表達蛋白。
　　2、采用生物信息學工具對所鑒定的差異表達蛋白進行功能分類，發(fā)現主要涉及細胞粘附蛋白、鈣結合蛋白、脂代謝