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文檔簡介
1、目的:建立成年大鼠心肌細胞缺氧復氧模型,觀察缺血后處理和吡那地爾后處理對鼠心肌細胞的影響,并探討Nrf2-ARE通路在缺血/吡那地爾后處理心肌保護中的作用。
方法:
1.建立Langendorff離體心臟灌注模型,分離、培養(yǎng)成年大鼠心肌細胞,并將其隨機分為正常組(N組)、對照組(C組)、缺血后處理組(IPO組)和吡那地爾不同濃度后處理組(25、50和100μM,P組)。分離后的心肌細胞培養(yǎng)20h,除N組持續(xù)培
2、養(yǎng)外,其余各組均缺氧45 min,復氧60 min。IPO組缺氧45 min后復氧、缺氧循環(huán)3次,每次各5 min,在繼續(xù)復氧60 min;P25、P50和P100組缺氧45 min后分別以25、50和100μM/L吡那地爾處理5 min,復氧60 min。
2.電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。
3.熒光共聚焦顯微鏡觀察復氧末心肌細胞內(nèi)鈣。
4.Real-Time PCR及Western blot技術(shù)
3、檢測復氧末心肌細胞中Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1的基因mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達情況。
結(jié)果:
1.電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu):N組超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常;IPO組、P25組、P50組、和P100組優(yōu)于C組,其中IPO組和P50組優(yōu)于P25組和P100組。
2.熒光共聚焦顯微鏡檢測心肌細胞內(nèi)鈣:與N組比較,其他各組熒光強度明顯增強(P<0.05);與C組比較,其他各組熒光強度明顯減弱(P<0
4、.05),其中IPO和P50組熒光強度明顯低于比P25和P100組(P<0.05),IPO與P50組相比,差異不顯著(P>0.05),而P25組熒光強度低于P100組(P<0.05)。
3.Nrf2、HO-1、NQO1及SOD1 mRNA表達量:與N組相比,其他各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄量明顯降低(P<0.05);與C組相比,其他各組基因mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著增高(P<0.05);其中IPO和
5、P50組基因mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于P25和P100組(P<0.05);P25與P100組Nrf2、HO-1和NQO1的基因mRNA轉(zhuǎn)錄無顯著差異(P>0.05),P25組SOD1基因mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于P100組(P<0.05)。
4.Nrf2、HO-1、NQO1及SOD1蛋白質(zhì)表達量:與N組相比,其余各組Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白質(zhì)表達量顯著降低(P<0.05);與C組相比,其余各組蛋白質(zhì)表達量增高(P
6、<0.05);其中P50組和IPO組Nrf2、SOD1、NQO1蛋白質(zhì)表達量顯著高于P25和P100組(P<0.05);IPO與P50組蛋白質(zhì)表達量比較,無顯著差異(P>0.05);P50組HO-1蛋白質(zhì)表達量顯著高于IPO組、P25和P100組(P<0.05);P25組HO-1和NQO1蛋白質(zhì)表達量顯著高于P100組(P<0.05)。
結(jié)論:
1.缺血、不同濃度吡那地爾后處理均能夠減少心肌細胞內(nèi)鈣,起到保護
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